葉 蕓，李蘇亮，鄭乃青(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，西安 710077;通訊作者，E-mail:yeyun236@163．com)

結(jié)腸癌是在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。近年來，關(guān)于結(jié)腸癌的基礎(chǔ)和臨床研究已取得很大進(jìn)步，但病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)，是多基因參與過程。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一類內(nèi)源性凋亡抑制因子家族，其過度表達(dá)引起細(xì)胞凋亡缺陷與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［1］。Livin基因是IAP家族成員，已有研究表明Livin基因是某些腫瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)［2］。然而，Livin基因在結(jié)腸癌發(fā)病中的作用、惡性侵襲和轉(zhuǎn)移的表達(dá)，以及是否可作為早期診治的靶點(diǎn)鮮見報(bào)道。本文通過研究凋亡抑制基因Livin在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義，旨在探討Livin表達(dá)在結(jié)腸癌的臨床診斷及病情評估中的作用。

1 材料和方法

1．1 研究對象

收集西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科2009－02－10～2012－06－31已行手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的結(jié)腸癌新鮮標(biāo)本96例，術(shù)前均未接受過化療或放療治療，女性32例，男性64例，年齡38－72歲，平均年齡(57±7．12)歲。結(jié)腸癌TNM分期采用AJCC標(biāo)準(zhǔn)(2010)，組織分型采用Lauren分型，結(jié)果顯示病理類型:高分化癌17、中分化癌26例，低分化癌53例;出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例，未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移54例;TNM分期:Ⅰ－Ⅱ期35例，Ⅲ－Ⅳ期61例。對照組:選取30例癌旁正常結(jié)腸組織(距腫瘤邊緣5 cm以上組織)。將每次所獲得的新鮮組織的一部分保護(hù)于RNA Waiter中，后存放于－80℃冰箱中，用于RT-PCR，另一部分新鮮組織經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋常規(guī)連續(xù)切片，用于免疫組織化學(xué)檢測。

1．2 主要試劑與儀器

Trizol購于美國Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連TAKARA生物科技公司(日本);puc19 Marker購于美國MBI生物科技公司;Taq酶購于日本Toyobo公司;PCR反應(yīng)的引物由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。

1．3 免疫組織化學(xué)染色檢測Livin蛋白表達(dá)

即用型鼠抗人單抗(珠海市泉暉企業(yè)有限公司)按SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。DAB顯色，蘇木精襯染，常規(guī)脫水、透明、封片。用PBS代替一抗進(jìn)行染色，作為陰性對照;用已知各抗體的陽性對照片作陽性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn):Livin染色陽性信號呈棕黃色細(xì)胞顆粒狀，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，在100倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，然后采用Image-Proplus5．0分析軟件在400倍光鏡下對陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，計(jì)算每個(gè)視野陽性染色的積分光密度(integral optical density，IOD)值，取5個(gè)視野IOD的均值為各組最終數(shù)據(jù)。

1．4 RT-PCR檢測Livin mRNA水平

Livin基因上游引物:5’－CCTGGTCTGTGCTGAGTGT－3’(上游)，5’－CTGGTCAGTGCTGGATGGA－3’(下游)，產(chǎn)物長度為 214 bp。10×buffer 5 μl、dNTP 4 μl、cDNA 5 μl、上下游引物各 5 μl、Tap酶 1 μl、PCR 用水 29 μl共 50 μl。PCR 反應(yīng)條件:94℃5 min、94℃1 min、58℃1 min退火、72℃延伸2 min共29循環(huán)。72℃10 min延長。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

選擇結(jié)腸癌患者的性別、年齡、浸潤深度、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等與臨床相關(guān)的因素，將Livin在各因素之間的表達(dá)情況行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17．0軟件系統(tǒng)分析所有數(shù)據(jù)，兩組積分光密度值以±s表示，采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;分類變量采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法進(jìn)行分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 免疫組化染色結(jié)果

Livin染色的陽性物質(zhì)呈棕黃色，表達(dá)于細(xì)胞膜、胞質(zhì)(圖1，見第504頁)。結(jié)腸癌組積分光密度值為147．67 ±5．09，對照組積分光密度值為112．68 ±4．51，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24．31，P ＜0．05)。

2．2 RT-PCR檢測結(jié)果

96例結(jié)直腸癌組織中77例Livin mRNA表達(dá)陽性(見圖2)，陽性率為80．2%，呈高表達(dá);30例對照組正常結(jié)腸組織1例表達(dá)陽性，陽性率為3．3%，呈低表達(dá)。兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=57．28，P ＜0．05)。

圖2 結(jié)腸癌組織、正常結(jié)腸組織中l(wèi)ivin基因電泳條帶圖Figure 2 Electrophoresis banding of Livin gene in colon cancer tissue and normal colon tissue

2．3 Livin與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

將96例患者的各項(xiàng)臨床相關(guān)資料行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示:Livin基因表達(dá)與TNM分期、分化程度及浸潤深度有關(guān)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，與性別、年齡、腫瘤病灶大小、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P＞0．05，見表1)。

表1 Livin基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)Table 1 The relationship between Livin expression and clinical pathological features cases(%)

3 討論

近年，結(jié)腸癌已成為我國發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率增長了100%。每年大約有14萬人新患結(jié)腸癌，占全部癌癥患者的6．8%。IAP是一類內(nèi)源性細(xì)胞抑制因子，其過度表達(dá)引起細(xì)胞凋亡不足與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［3］。Livin是IAP成員，Ashhab等［4］經(jīng)序列分析顯示Livin蛋白質(zhì)有兩種剪切異構(gòu)體，長度分別為1 321 bp及1 267 bp，分別稱為Livin α及Livin β。Livin基因位于人染色體20q13．3，全長4．6 kb，包含 7 個(gè)外顯子和 6 個(gè)內(nèi)含子。Livin在N端含有一個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，C端含有一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域。Livin BIR包含4個(gè)α螺旋、1個(gè)三股的反平行β片層以及相應(yīng)的氨基酸殘基共同構(gòu)成的疏水核心。Livin α cDNA全長897，編碼298個(gè)氨基酸;Livin β cDNA全長843，編碼280個(gè)氨基酸。Livin α與β，除了在BIR與RING間相差18個(gè)氨基酸外，兩者結(jié)構(gòu)非常相似，兩者相差的18個(gè)氨基酸由介于BIR和RING結(jié)構(gòu)之間的第6外顯子5’端54的基因序列編碼。Livin在胚胎組織中存在，在胎兒發(fā)育過程中多種組織高表達(dá)，在正常成人的大多數(shù)終末組織中(除胎盤)低表達(dá)或不表達(dá)，正常大腸組織中無 Livin基因的表達(dá)［5－7］。

隨著對多種腫瘤中Livin的研究，顯示Livin在很多腫瘤組織中表達(dá)，如在黑色素瘤、人子宮頸癌Hela細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、白血病T細(xì)胞、鼻咽癌上均有顯著性過表達(dá)現(xiàn)象［8，9］，這些研究結(jié)果提示，Livin的表達(dá)可能是維持腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長的重要因素。最近研究還發(fā)現(xiàn)在消化道腫瘤中，如胃癌、胰腺癌及肝癌中均見Livin呈過度表達(dá)［10］。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)，是多基因參與過程。已有研究表明，Livin基因是某些腫瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)［11］。然而，Livin基因在結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用、惡性生物學(xué)行為(侵襲和轉(zhuǎn)移)的表達(dá)，以及是否可作為早期診斷及治療的靶點(diǎn)鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化及PCR技術(shù)檢測了Livin基因在結(jié)腸癌組織及正常結(jié)腸組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Livin基因在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，在正常結(jié)腸組織中低表達(dá);Livin基因表達(dá)與TNM分期、分化程度及浸潤深度有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤病灶大小、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)。因此，檢測Livin基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)對結(jié)腸癌的臨床診斷及病情評估有重要作用。

［1］Kim KS，Zhang L，Williams D，et al．Discovery of tetrahydroisoquinoline-based bivalent heterodimeric IAP antagonists［J］．Bioorg Med Chem Lett，2014，24(21):5022－5029．

［2］Lee DH，Yoon TM，Kim SA，et al．Relationship between expression of Livin and the biological behavior of human oral squamous cell carcinoma［J］．Oncol Rep，2014，32(6):2453－ 2460．

［3］Pop C，Salvesen GS．Human caspases:activation，specificity，and regulation［J］．J Biol Chem，2009，284(33):21777 –21781．

［4］Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al．Two splicing variants of a new inhibior of apoptosis gene with different different biological properties and tissue distribution pattern［J］．FEBS Lett，2001，495(1－2):56－60．

［5］Kasof G M，Gomes BC．Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］．J Biol Chem，2001，276(5):3238－3246．

［6］Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al．ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］．Curr Biol，2000，10(21):1359－1366．

［7］Lin JH，Deng G，Huang Q，et al．KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］．Biochem Biophys Res Commun，2000，279(3):820－831．

［8］Crnkovic-Mertens I，Hoppe-Seyler F，Butz K．Induction of tumor cells by siRNA-mediated silencing of the Livin/ML-IAP/KIAP gene［J］．Oncogene，2003，22(51):8330－8336．

［9］Tanabe H，Yagihashi A，Tsuji N，et al．Expression of survivin mRNA and Livin mRNA in non-small-cell lung cancer［J］．Lung Cancer，2004，46(3):299－304．

［10］Yagihashi A，Asanuma K，Tsuji N，et al．Detection of anti-Livin antibody ingastrointestinal cancer patients［J］．Clin Chem，2003，49(7):1206－1208．

［11］Myung DS，Park YL，Chung CY，et al．Expression of Livin in colorectal cancer and its relationship to tumor cell behavior and prognosis［J］．PLos One，2013，8(9):e73262．