武 康，張卓偉，朱麗靜，梁佳佳，武希潤(rùn)(山西醫(yī)科大學(xué)影像系，太原 03000;山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科;通訊作者，E-mail:xirunwu66@6.com)

肝硬化病人大多存在出血傾向，以往研究認(rèn)為，其主要與肝臟合成凝血因子減少、脾功能亢進(jìn)、免疫異常導(dǎo)致血小板減少有關(guān)。色素上皮衍生因子(pigment pithelium-derived factor，PEDF)是 1989 年Tombran-Tink等從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)液中分離純化的一種可溶性糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，是一種內(nèi)生性多功能因子，有研究表明，PEDF通過(guò)氧化應(yīng)激可抑制血小板P選擇素的表達(dá)和血小板的聚集，但PEDF在乙肝肝硬化患者血液中變化及其與肝硬化血小板活化、聚集是否存在相關(guān)關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙肝肝硬化患者血中PEDF變化，分析其與肝硬化血小板活化、聚集相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2012-11～2013-01乙肝肝硬化患者37例，所有入選病例均根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、胃鏡和腹部彩超或CT檢查確診，其中山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院6例，山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院18例，山西省人民醫(yī)院13例。其中男28例，女9例，年齡34-81歲，平均(54±10)歲，按照肝硬化Child-Pugh分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將37例患者分為3組，Child-Pugh A級(jí)15例，B級(jí)12例，C級(jí)10例。正常健康體檢10例作為對(duì)照組，男7例，女3例，年齡28-57歲，平均(47±9)歲。

1.2 主要試劑儀器

ADP誘導(dǎo)劑、CD61-FITC、CD62P-PE、CD63-PE、IgG-PE購(gòu)自法國(guó)Immunotech公司;鏈霉親和素-HRP、生物素標(biāo)記的抗PEDF抗體購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。Allegra X-12離心機(jī)、FACSC流式細(xì)胞儀、LH750型血小板聚集儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司;多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自鄭州安圖生物科技有限公司。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

CD62P、CD63的測(cè)定:晨起空腹肘中靜脈采血2.7 ml，加入含3.2%枸櫞酸鈉抗凝劑的真空采血管中，輕輕混勻，2 000 r/min離心5 min制備富血小板血漿(PRP)。取3支離心管，分別加入CD61-FITC IgG1-PE(同型對(duì)照)、CD61-FITC CD62P-PE、CD61-FITC CD63-PE 各 5 μl，各加入 PRP 10 μl，室溫避光孵育20 min;加入適量PBS緩沖液，輕輕搖勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1%多聚甲醛200 μl，輕輕搖勻，24 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將前向散射(FSC)和側(cè)向散射(SSC)的檢測(cè)信號(hào)均設(shè)置為對(duì)數(shù)放大，并初步圈出血小板群;利用流式細(xì)胞術(shù)設(shè)邏輯門，以CD61-FITC和SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門，再圈出CD61陽(yáng)性表達(dá)的血小板群，門內(nèi)采集＞10 000個(gè)血小板，分析CD62P、CD63陽(yáng)性的百分率。

血小板聚集率(platelet aggregation rate，PAgT)測(cè)定:晨起空腹肘中靜脈采血2.7 ml，加入含3.2%的枸櫞酸鈉抗凝劑的真空采血管中，800 r/min離心5 min，取上清 200 μl，加入 ADP 誘導(dǎo)劑(5 μmol/L)10 μl，2 h 內(nèi)血小板聚集儀測(cè) PAgT。

PEDF測(cè)定:晨起抽取空腹肘中靜脈血5 ml，加入含抗凝劑的真空采血管中，3 000 r/min離心10 min，取上清置于Eppendorf管中，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)PEDF濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 乙肝肝硬化患者CD62P、CD63的變化

乙肝肝硬化患者血小板CD62P陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);乙肝肝硬化B級(jí)、C級(jí)患者血小板CD63的表達(dá)較正常對(duì)照組有所增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 乙肝肝硬化患者CD62P、CD63的變化(±s)Table 1 Plasma levels of CD62P，CD63 in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

表1 乙肝肝硬化患者CD62P、CD63的變化(±s)Table 1 Plasma levels of CD62P，CD63 in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

與對(duì)照組比較，△P＜0.05;與A級(jí)比較，#P＜0.05;與B級(jí)比較，★P ＜0.05

組別 n CD62P(%) CD63(%)對(duì)照組10 5.28 ±1.27 2.30 ±0.72乙肝肝硬化組A 級(jí) 15 14.79 ±1.82△ 2.95 ±0.64△B 級(jí) 12 11.30 ±2.09△# 3.97 ±0.92△#C 級(jí) 10 10.24 ±1.62△★ 3.35 ±0.76△F 59.19 9.40 P ＜0.05 ＜0.05

2.2 乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF的變化

乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表2)。

表2 乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF的變化(±s)Table 2 Plasma levels of PAgT and PEDF in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

表2 乙肝肝硬化患者PAgT、PEDF的變化(±s)Table 2 Plasma levels of PAgT and PEDF in patients with hepatitis B cirrhosis(±s)

與對(duì)照組比較，#P＜0.001;與 A 級(jí)比較，△P ＜0.05;與B 級(jí)比較，★P ＜0.05

組別 n PAgT(%) PEDF(ng/L)對(duì)照組10 39.43 ±2.37 231.36 ±4.81乙肝肝硬化組A 級(jí) 15 21.39 ±1.92# 52.40 ±2.74#B 級(jí) 12 30.69 ±2.57#△ 46.26 ±5.04#△C 級(jí) 10 20.12 ±2.37#★ 48.68 ±4.33#F 172.38 4 914.04 P ＜0.05 ＜0.05

2.3 相關(guān)性分析

乙肝肝硬化患者血液中PEDF的表達(dá)與CD62P呈負(fù)相關(guān)(r=-0.755，P ＜0.05)，與 PAgT 呈正相關(guān)(r=0.791，P ＜0.05)。

3 討論

肝硬化患者大多存在出血傾向，以往研究多集中在肝硬化脾大、脾功能亢進(jìn)導(dǎo)致血小板數(shù)量改變，也有研究表明乙肝病毒復(fù)制影響骨髓巨核細(xì)胞增殖、活化［1］，而對(duì)乙肝肝硬化血小板聚集與活化功能變化的研究較少。

血小板膜上含有a-顆粒、致密顆粒及溶酶體，這些顆粒膜蛋白在靜止期不表達(dá)或少量表達(dá)。當(dāng)血小板活化時(shí)，a顆粒立即與血小板質(zhì)膜發(fā)生融合釋放CD62P，且CD62P只在活化的血小板表面表達(dá)，不被血漿蛋白所掩蓋，不隨時(shí)間的推移而在活化血小板表面消失。因此，CD62P在血小板質(zhì)膜上的表達(dá)或其陽(yáng)性血小板的百分率的增加被認(rèn)為是活化血小板的特異性標(biāo)志。CD63又稱溶酶體顆粒膜糖蛋白，血小板溶酶體在較強(qiáng)刺激劑誘導(dǎo)下緩慢與血小板質(zhì)膜融合，釋放內(nèi)容物，在血小板表面表達(dá)溶酶體顆粒膜糖蛋白，因此，CD63也是血小板活化的特異性指標(biāo)，血小板質(zhì)膜上檢測(cè)到CD63被認(rèn)為是血小板已被較高程度活化。

童照威等［2］對(duì)32例乙型肝炎后硬化患者研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者血小板表面CD62P、CD63增高不僅與血小板過(guò)度破壞有關(guān)，還與體內(nèi)血小板活化程度有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙肝肝硬化患者血中CD62P、CD63陽(yáng)性百分率與對(duì)照組比較均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示乙肝肝硬化患者存在血小板活化異常。

血小板聚集是血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)通過(guò)纖維蛋白原(Fg)與另一血小板膜GPⅡb/Ⅲa結(jié)合的聚合能力，顯示活化的血小板相互作用聚集成團(tuán)的特征，是血小板的一種重要止血功能。龔文勝等［3］對(duì)121例門脈性肝硬化患者及52例對(duì)照組進(jìn)行PAgT檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝硬化組血小板功能明顯下降，表明乙肝肝硬化除存在血小板數(shù)量的減少外，常有血小板功能的減退。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)乙肝肝硬化患者血小板聚集率明顯降低，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明乙肝肝硬化患者存在血小板聚集功能降低。

PEDF是一種具有多種生理作用的保護(hù)因子，廣泛分布在人體的腦、眼、胎盤、睪丸、卵巢、前列腺等組織中，抗氧化應(yīng)激是PEDF眾多生理作用的樞紐［4，5］，PEDF 可通過(guò)其抗氧化應(yīng)激性抑制 NADPH活化，減少ROS生成，抑制血小板P選擇素的表達(dá)和血小板的聚集，起到抗血小板聚集及血栓形成［6-8］。肝硬化患者存在血小板數(shù)量及功能的異常，但是否存在肝硬化患者血中PEDF變化與血小板活化、聚集相關(guān)關(guān)系目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。我們采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)37例乙肝肝硬化患者血清中PEDF變化，結(jié)果血中PEDF濃度較正常對(duì)照組明顯減少，提示乙肝肝硬化中存在保護(hù)性因子PEDF減少。分析乙肝肝硬化患者血液中PEDF表達(dá)與CD62P、PAgT相關(guān)關(guān)系，結(jié)果表明，PEDF的表達(dá)與CD62P呈負(fù)相關(guān)，與PAgT呈正相關(guān)，表明乙肝肝硬化患者血清PEDF變化影響其血小板活化和聚集，推測(cè)乙肝肝硬化患者血清PEDF降低，血小板活化和聚集功能異?？赡芤彩歉斡不鲅L(fēng)險(xiǎn)增大的原因之一。

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