帥娜娜， 王昌祿， 陳勉華， 王玉榮， 徐小洲， 王文杰， 葉 峰

（1.慶陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅慶陽(yáng)745000；2.食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津河西300457；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津市農(nóng)科院飼料工程技術(shù)研究中心，天津西青 300112；4.南開(kāi)大學(xué)蓖麻工程中心，天津南開(kāi) 300071）

有研究表明，自然界中有許多微生物可以降解或轉(zhuǎn)化有毒物質(zhì) （Dubey和Holmes，1995）。 利用生物法脫毒不但能除去蓖麻餅粕中的蓖麻堿和變應(yīng)原，還可以提高蓖麻餅粕的粗蛋白質(zhì)含量（Pandey等，1999）。但目前研究?jī)?nèi)容大多集中在菌種選育、發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化以及發(fā)酵后蓖麻餅粕營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定等方面，因此有必要開(kāi)展對(duì)含有蓖麻餅粕的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化研究，使生物法的脫毒效果得到進(jìn)一步提高。

本試驗(yàn)利用對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原具有較強(qiáng)降解力的SJM酵母菌對(duì)蓖麻餅粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，研究不同輔料和添加劑等因素對(duì)蓖麻餅粕生物脫毒效果的影響。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)降解蓖麻堿和變應(yīng)原的蓖麻餅粕培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料 菌種：SJM酵母，本試驗(yàn)室篩選保存。

蓖麻餅粕（熱榨）：由慶陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院某植物蛋白生產(chǎn)基地提供，其主要成分含量：粗蛋白質(zhì)35.67%，粗纖維33.87%，粗脂肪7.37%，粗灰分6.51%，蓖麻堿0.169%，變應(yīng)原0.736%。

蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)品：純度98%，最大吸收波長(zhǎng)為312 nm，相對(duì)分子質(zhì)量為164.16。

變應(yīng)原標(biāo)準(zhǔn)品：按北京市糧食科學(xué)研究所情報(bào)資料室方法分離得到變應(yīng)原，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)為純品。

1.2 方法

1.2.1 蓖麻堿的提取和檢測(cè) 準(zhǔn)確稱(chēng)取蓖麻餅粕10.0 g索式抽提器中，加入氯仿150 mL，回流提取10 h，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，用甲醇充分溶解，過(guò)濾，于100 mL容量瓶定容，吸取1 mL定容在10 mL容量瓶中，用紫外分光光度計(jì)在312 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蓖麻堿含量。

1.2.2 變應(yīng)原的提取和檢測(cè) 準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)粉碎、過(guò)40目篩的樣品20.0 g，置回流裝置中，加蒸餾水200 mL微沸提取5 h，取上清液，減壓濃縮，加入乙醇至25%，離心，取上清夜，加入適量的10%醋酸鉛乙醇溶液，離心。調(diào)整上清液乙醇濃度為75%，離心，取沉淀，用緩沖生理鹽水溶解，加入2 mL雙縮脲試劑，用緩沖生理鹽水定容至10 mL，充分混勻，于60℃水浴加熱5 min，冷卻至室溫，于紫外分光光度計(jì)550 nm下測(cè)其吸光度。

1.2.3 輔料的選擇 按15%接種量，將SJM酵母接入添加不同配比輔料的蓖麻餅粕中，底物組成見(jiàn)表1。調(diào)整其含水量為65%，121℃滅菌20 min，30℃培養(yǎng)5 d，取出，于50℃烘箱中干燥，粉碎，過(guò)40目篩備用。紫外分光光度法檢測(cè)脫毒前后蓖麻堿和變應(yīng)原含量。

表1 含有不同比例蓖麻餅粕的培養(yǎng)基組成 %

1.2.4 金屬離子對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響蓖麻餅粕85%，麩皮15%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基含水量為65%。分別按干基重添加0.4%的MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O、CuSO4·5H2O。 發(fā)酵條件不變。

1.2.5 CaCl2對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響蓖麻餅粕85%，麩皮15%，CaCl2按干基重0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%添加，調(diào)整培養(yǎng)基含水量為65%。發(fā)酵條件不變。

1.2.6 KH2PO4對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響蓖麻餅粕 85%，麩皮 15%，KH2PO4按干基重0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%添加， 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基含水量為65%。發(fā)酵條件不變。

1.2.7 正交試驗(yàn) 以蓖麻餅粕作為固態(tài)發(fā)酵法降解蓖麻堿和變應(yīng)原的基本培養(yǎng)基原料，選擇麩皮、MgSO4·7H2O、CaCl2和 KH2PO4作為考察因素，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。優(yōu)化SJM酵母脫毒培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔料的選擇 由圖1可以看出，SJM酵母菌接種到添加不同比例輔料的培養(yǎng)基后，都不同程度提高了蓖麻堿和變應(yīng)原的降解率。在蓖麻餅粕培養(yǎng)基中添加麩皮對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原的影響最大，蓖麻堿和變應(yīng)原的降解率分別達(dá)到80.76%和83.78%。

圖1 不同輔料配比對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響

2.2 金屬離子對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響由圖2可知，在培養(yǎng)基中添加0.4%的MgSO4·7H2O，蓖麻堿及變應(yīng)原的降解率最高，分別為84.65%和 86.64%。 相反， 添加 FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O 和 CoSO4·H2O 后，蓖麻堿和變應(yīng)原降解率下降，可能是Fe2+、Cu2+和Co2+影響了菌體的生長(zhǎng)，抑制了酶的合成。

圖2 金屬離子對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響

2.3 CaCl2對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響 由圖3可知，培養(yǎng)基中CaCl2的添加量在0.05%～0.2%時(shí)，酵母菌對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原的降解率隨著添加量的增大而提高，添加量為0.2%時(shí)，降解率最大。此后隨著CaCl2添加量的增加，蓖麻堿和變應(yīng)原降解率有所下降。

2.4 KH2PO4對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響由圖4可知，KH2PO4最適添加量為0.4%，過(guò)高和過(guò)低都不利于蓖麻堿和變應(yīng)原的降解。

2.5 培養(yǎng)基的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表2。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

圖3 CaCl2添加量對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響

圖4 KH2PO4添加量對(duì)蓖麻堿和變應(yīng)原降解率的影響

表2 因素與水平 %

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，各因素對(duì)蓖麻堿降解率的影響次序?yàn)辂熎ぃ?MgSO4·7H2O ＞ CaCl2＞ KH2PO4，最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C2D3，即麩皮15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.5%。

表4 以蓖麻堿降解率為指標(biāo)的極差分析結(jié)果

由表5可知，各因素對(duì)變應(yīng)原降解率的影響次序?yàn)辂熎ぃ?KH2PO4＞ MgSO4·7H2O ＞ CaCl2，最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C2D2，即麩皮15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.4%。

表5 以變應(yīng)原降解率為指標(biāo)的極差分析結(jié)果

綜合蓖麻堿降解率和變應(yīng)原降解率兩個(gè)指標(biāo)及經(jīng)濟(jì)原則，選擇最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C2D2，即麩皮 15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.4%。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最佳培養(yǎng)基組成，調(diào)整培養(yǎng)基含水量為65%，按15%接種量接入SJM酵母，30℃培養(yǎng)5 d，測(cè)得蓖麻堿平均降解率為86.95%，變應(yīng)原平均降解率90.83%。

3 結(jié)論

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，輔料、金屬離子及礦物質(zhì)的添加對(duì)SJM酵母降解蓖麻餅粕中的蓖麻堿和變應(yīng)原均有一定影響。

3.2 采用正交試驗(yàn)對(duì)SJM酵母發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，最佳培養(yǎng)基組合為麩皮15%、MgSO4·7H2O 0.4%、CaCl20.2%、KH2PO40.4%，此時(shí)蓖麻餅粕中蓖麻堿和變應(yīng)原的降解率均較高，分別為86.95%和90.83%。

[1]Dubey S K，Holmes D S.Biological cyanide destruction mediated by microorganisms[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，1995，11（3）：257 ～ 265.

[2]Pandey A，Soccol C R，Nigam P，et al.Biotechnological potential of agroindustrial residues II：Cassava bagasse[J].Bioresource Technology，1999，74：81 ～87.