張魯新， 李呂木，2*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

非蛋白氮即非蛋白質(zhì)狀態(tài)的含氮化合物，包括有機(jī)物和無機(jī)物。動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)中，非蛋白氮指飼料中蛋白質(zhì)以外的含氮化合物的總稱，包括游離氨基酸、蛋白質(zhì)降解的含氮化合物、尿素及其衍生物類、氨及銨鹽類化合物和酰胺類化合物 （韓曉平，2013）。尿素及其衍生物類包括尿素、縮二脲、縮三脲、磷酸脲、羥甲基尿素、亞異丁基二脲、硬脂酸尿素等。氨及銨鹽包括液氨、磷酸銨、硫酸銨、氯化銨、甲酸銨、硝酸銨、聚磷酸銨、乳酸銨、氰酸銨、碳酸氫銨、氨基甲酸銨等。酰胺化合物包括谷酰胺、天冬酰胺和雙氰胺等。本文對(duì)微生物利用非蛋白氮的機(jī)理以及一些微生物利用非蛋白氮轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)菌體蛋白的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為飼用微生物蛋白的開發(fā)提供參考。

1 微生物利用非蛋白氮的機(jī)理

自然界中多種微生物可以利用非蛋白氮類物質(zhì)合成自身生長(zhǎng)需要的蛋白質(zhì)，微生物在體內(nèi)酶的作用下將非蛋白含氮物質(zhì)降解為氨，氨在酶的催化作用下進(jìn)一步被同化為氨基酸，氨基酸經(jīng)過體內(nèi)的代謝最終生成菌體蛋白。

1.1 微生物利用氨及銨鹽類轉(zhuǎn)化為菌體蛋白的機(jī)理 氨及銨鹽類物質(zhì)在微生物生長(zhǎng)基質(zhì)中解離為銨離子，微生物吸收銨離子進(jìn)入體內(nèi)并在谷氨酰胺合成酶的作用下與谷氨酸反應(yīng)生成谷氨酰胺（Geisseler等，2010），轉(zhuǎn)氨酶催化谷氨酰胺發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用進(jìn)而合成其他氨基酸，多種氨基酸作為蛋白質(zhì)合成的前體物質(zhì)經(jīng)過蛋白質(zhì)合成酶的催化合成微生物菌體蛋白。此外微生物直接利用α-酮戊二酸和NH3在谷氨酸合酶的作用下生成谷氨酸（Jo等，2012），谷氨酸和氨通過上述過程轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，此為微生物利用氨的另一種途徑。微生物同化氨及銨鹽類物質(zhì)為菌體蛋白最重要的酶是微生物谷氨酰胺合成酶，因?yàn)樵撁冈跓o機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮過程中起著重要的橋梁作用，為后續(xù)微生物蛋白質(zhì)的生物合成提供最基本的前體物質(zhì)。

1.2 微生物利用尿素及其衍生物轉(zhuǎn)化為菌體蛋白的機(jī)理 尿素及其衍生物不能直接被微生物同化為菌體蛋白質(zhì)，而是要轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌妆晃⑸镂绽玫姆堑鞍椎镔|(zhì)而被微生物利用。尿素主要通過兩種途徑被微生物利用。第一種途徑是，尿素被微生物分泌的脲酶催化降解為氨和二氧化碳（Balasubramanian 等，2013），氨通過 1.1 中介紹的途徑最終轉(zhuǎn)化為微生物蛋白質(zhì)。第二種途徑是，尿素首先經(jīng)尿素羧化酶（UC）催化生成脲基甲酸酯，生成的脲基甲酸酯被脲基甲酸酯水解酶分解為銨和二氧化碳（Kanamori等，2004）。其中銨被微生物吸收，繼而經(jīng)過1.1中介紹的途徑最終生成菌體蛋白。Merloni等（2014）報(bào)道，脲酶屬于金屬離子依賴型催化酶，它的催化活性依賴于結(jié)合在其活性位點(diǎn)的鎳離子，非活性脫輔基脲酶轉(zhuǎn)化為活性全息脲酶需要兩個(gè)鎳離子插入底物結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)過程需要UreD、Uref、UreG和UreE 4個(gè)輔助蛋白參與完成。因此在添加尿素及其衍生物作為氮源供微生物生長(zhǎng)利用的基質(zhì)中必須要有適量的鎳離子存在，以保證微生物對(duì)非蛋白氮類物質(zhì)的利用。尿素羧化酶廣泛分布在許多細(xì)菌、藻類和真菌體內(nèi)，它能催化尿素轉(zhuǎn)化為脲基甲酸酯，這個(gè)過程是生物體利用尿素作為氮源的基本步驟（Strope 等，2011）。 Tong（2013）報(bào)道，尿素羧化酶屬于生物素依賴性羧化酶家族，和家族其他酶具有相同的生物素羧化酶和生物素羧基載體蛋白結(jié)構(gòu)域，但其羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域與家族其他酶截然不同。Fan等（2012）在對(duì)乳酸克魯維酵母尿素羧化酶的晶體結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，生物素羧基載體蛋白結(jié)構(gòu)域與羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域相互作用將生物素和尿素綁定在其活性位點(diǎn)進(jìn)而催化尿素轉(zhuǎn)化為脲基甲酸酯。脲基甲酸酯水解酶存在于很多生物中，并且是生物利用尿素作為氮源必不可少的酶。Fan等（2013）在對(duì)乳酸克魯維酵母脲基甲酸酯水解酶晶體結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，其N和C結(jié)構(gòu)域催化兩步反應(yīng)并保持酶的二聚體形式，其二聚體形式是保證酶最佳活性所必須，此外C結(jié)構(gòu)域催化一種新穎的脫羧反應(yīng)，這種反應(yīng)普遍存在于生物系統(tǒng)。

2 不同微生物對(duì)非蛋白氮的利用

微生物可以利用廉價(jià)的廢料生成自身的菌體蛋白。常用來生產(chǎn)菌體蛋白的微生物種類有某些藻類、真菌和細(xì)菌。藻類含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和維生素 A、B、C、D、E（Raposo等，2013）。 藻類本身的核酸含量低，作為飼料對(duì)動(dòng)物健康危害小，有很好的開發(fā)前途。Wang等（2011）報(bào)道真菌蛋白的氨基酸組成平衡，而細(xì)菌雖含有較高的蛋白質(zhì)和某些必需氨基酸，粗蛋白質(zhì)含量占干重的80%，但是含有較高的核酸，特別是RNA占到干重的15%～16%，而核酸在降解代謝過程中會(huì)產(chǎn)生尿酸，過多的尿酸在動(dòng)物體內(nèi)沉積于關(guān)節(jié)等處，引發(fā)痛風(fēng)對(duì)動(dòng)物成長(zhǎng)有害 （Zare等，2006）。這對(duì)細(xì)菌作為飼料蛋白源產(chǎn)生非常不利的影響。

2.1 真菌利用非蛋白氮合成菌體蛋白

2.1.1 假絲酵母 產(chǎn)朊假絲酵母又叫食用圓酵母，是一種易消化、營養(yǎng)豐富的食用酵母，其中含有超過50%的蛋白質(zhì)，富含賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、谷氨酸、礦物質(zhì)及煙酸、泛酸 和B族維生素。

Watanabe等（2013）利用產(chǎn)朊假絲酵母處理燒酒廢水生產(chǎn)飼料酵母，培育出一個(gè)可以累積大量氮的產(chǎn)朊假絲酵母突變體。用其處理高濃度的燒酒廢水，可去除未稀釋的大麥燒酒廢水中62.9%有機(jī)物、38.4%總氮、44.5%總磷，每升處理后的大麥燒酒廢水經(jīng)冷凍干燥得到大約16.7 g酵母生物量，其中含有約60%的粗蛋白質(zhì)，用H2SO4調(diào)控pH值，不僅可提高廢水硫含量，而且還可增加酵母沉淀生物質(zhì)中蛋氨酸的含量。Jebasingh等（2013）研究報(bào)道，產(chǎn)朊假絲酵母在18.81 g/L的糖濃度、8.71 g/L的硫酸銨和0.69 g/L的硫酸鎂的條件下，可以獲得6.69 g/L生物質(zhì)，蛋白質(zhì)含量可達(dá)50%以上；樹木假絲酵母在18.42 g/L的糖濃度、8.95 g/L的硫酸銨和0.66 g/L硫酸鎂的條件下，可得到6.74 g/L生物量，蛋白質(zhì)含量可達(dá)49.37%。產(chǎn)朊假絲酵母可利用尿素和硫酸銨作為氮源合成谷胱甘肽，尿素和硫酸銨用作合成谷胱甘肽氮源的最佳C/N比分別為5.6和8.3。與硫酸銨相比，尿素轉(zhuǎn)化成谷胱甘肽的效率更高 （Wang等，2010）。在初始糖濃度為20 g/L香蕉皮水解物、9.59 g/L （NH4）2SO4、3 g/L KH2PO4、5.72 g/L L-蛋氨酸和0.20 g/L硫酸鎂條件下，產(chǎn)朊假絲酵母可利用香蕉皮的水解物高效生產(chǎn)谷胱甘肽，最大細(xì)胞干重和谷胱甘肽量可分別達(dá)到7.68 g/L和111.33 mg/L（kuforiji和 Aboaba，2010）。

Chen等（2011）報(bào)道熱帶假絲酵母蛋白質(zhì)含量高，尤其是具有較高賴氨酸和色氨酸水平。熱帶假絲酵母已經(jīng)應(yīng)用于低蛋白質(zhì)食品原料的蛋白質(zhì)富集，如發(fā)酵玉米和木薯混合物時(shí)混合物蛋白質(zhì)含量提高至20%，熱帶假絲酵母在3.5%果糖作為碳源和0.2%尿素作為氮源24 h干物質(zhì)平均生成率達(dá)1.4 g/L。解脂假絲酵母在pH值為5.5，添加50 g/L甘油、1 g/L硫酸銨及其他營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，可獲得17.8 g/L的最大生物量濃度、18.2%的蛋白含量和3.1%總蛋白產(chǎn)量。解脂假絲酵母培養(yǎng)在粗甘油培養(yǎng)基比培養(yǎng)在分析級(jí)甘油培養(yǎng)基培養(yǎng)生物量濃度、蛋白質(zhì)含量和總蛋白量分別提高1.2、1.5、1.9 倍（Santos等，2010）。

2.1.2 其他真菌 米曲霉在0.75%的尿素條件下發(fā)酵木薯漿4 d，蛋白質(zhì)和氨基氮含量由2.59%和0.89%分別提高到17.4%和15.13%（Thongkratok 等，2010）。研究表明，綠色木霉生產(chǎn)效率高，對(duì)氮源的要求低，是生產(chǎn)真菌生物蛋白最好菌株，它在不添加氮源的情況下經(jīng)過搖瓶發(fā)酵可產(chǎn)超過5 g/L的真菌生物質(zhì)，而米曲霉和黑曲霉在加入0.5～1.0 g/L的（NH4）2SO4條件下生成5 g/L的真菌生物質(zhì)。米曲霉和黑曲霉菌株產(chǎn)生的生物質(zhì)含有約36%的蛋白質(zhì)，而綠色木霉產(chǎn)生的生物質(zhì)含有19.8%的蛋白質(zhì)，米曲霉和黑曲霉具有較高的蛋白質(zhì)含量，可以利用（NH4）2SO4生產(chǎn)真菌蛋白 （Zhang等，2009）。卵形孢球托霉也可用來合成蛋白質(zhì)，在5%尿素和初始水分70%條件下，發(fā)酵蘋果渣，可產(chǎn)生19.63%可溶性蛋白（Vendruscolo 等，2009）。

2.2 藻類對(duì)非蛋白氮的利用 藻類含有進(jìn)行光合作用的光合色素，能吸收外界環(huán)境的含氮物質(zhì)轉(zhuǎn)化為自身的蛋白質(zhì)。小球藻不僅蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成合理，還含有豐富的生物活性物質(zhì)（Lodgelvry 等，2014）。 Mahboob 等（2012）以尿素為氮源，在10 L照明玻璃反應(yīng)器中純培養(yǎng)耐熱小球藻，獲得的小球藻類富含60%的粗蛋白質(zhì)，并含有0.52%類胡蘿卜素。淡水小球藻以尿素為氮源，葡萄糖為碳源進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，67 h內(nèi)其干物質(zhì)平均生長(zhǎng)率可達(dá) 1.22 g/L（Doucha 和 Livansky，2012）。

3 小結(jié)

微生物菌體蛋白早已作為蛋白質(zhì)飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖中，但現(xiàn)階段微生物對(duì)非蛋白氮的有效轉(zhuǎn)化率仍不高。因此，在微生物菌體蛋白的生產(chǎn)中采用基因工程方法以及其他分子生物學(xué)手段，選育非蛋白氮高效利用菌，以及利用創(chuàng)新技術(shù)設(shè)計(jì)高效的生物反應(yīng)器，提高非蛋白氮的轉(zhuǎn)化率均將推動(dòng)非蛋白氮轉(zhuǎn)化為微生物蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，并可促進(jìn)發(fā)酵蛋白飼料生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)含量的有效提高。同時(shí)，在研究非蛋白氮轉(zhuǎn)化為微生物蛋白的同時(shí)，結(jié)合進(jìn)行含糖量高的廢棄物作為碳源的協(xié)同研究，將有利于促進(jìn)非蛋白氮轉(zhuǎn)化為微生物蛋白的進(jìn)程。

[1]韓曉平.非蛋白氮的開發(fā)和利用[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2013，10：126～127.

[2]Balasubramanian A，Durairajpandian V，Elumalai S，et al.Structural and functional studies on urease from pigeon pea （Cajanus cajan）[J].International journal of biological macromolecules，2013，58：301～309.

[3]Chen X D，Wei G Y，Zhang J L.Efficient production of glutathione using hydrolyzate of banana peel as novel substrate[J].Korean Journal of Chemical Engineering，2011，28（7）：1566～1572.

[4]Doucha J，Livansky K.Production of high density Chlorella culture grown in fermenters[J].Journal of Applied phycology，2012，24（1）：35～43.

[5]Fan C，Chou C Y，Tong L，et al.Crystal Structure of Urea Carboxylase Provides Insights into the Carboxyltransfer reaction[J].Journal of biological chemistry，2012，287（12）：9389～9398.

[6]Fan C，Li Z，Yin H Y，et al.Structure and Function of Allophanate Hydrolase[J].Journal of biological chemistry，2013，288（29）：21422～21432.

[7]Geisseler D，Horwath W R，Joergensen R G.Pathways of nitrogen utilization by soil microorganisms-A review[J].Soil biology&biochemistry，2010，42（12）：2058～2067.

[8]Jebasingh S E J，Lakshmikandan M，Rajesh R P.Biodegradation of acrylamide and purification of acrylamidase from newly isolated bacterium Moraxella osloensis MSU11[J].International Biodeterioration&Biodegradation，2013，85：120～125.

[9]Jo J H，Seol H Y，Lee Y B，et al.Disruption of genes for the enhanced biosynthesis of alpha-ketoglutarate in Corynebacterium glutamicum[J].Canadian journal of microbiology，2012，58（3）：278～286.

[10]Kanamori T，Kanou N，Atomi H，et al.Enzymatic characterization of a prokaryoticureacarboxylase[J].Journalofbacteriology，2004，186（9）：2532～2539.

[11]Kuforiji O O，Aboaba O O.Application of Candida Valida as a Protein Supplement[J].Journal of Food Safety，2010，30（4）：969～981.

[12]Lodge-Ivey S L，Tracey L N，Salazar A.Ruminant Nutrition Symposium：The utility of lipid extracted algae as a protein source in forage or starchbased ruminant diets[J].Journal of Animal science，2014，92（4）：1331～1342.

[13]Mahboob S，Rauf A，Ashraf M，et al.High density growth and crude protein productivity of a ther-motolerant Chlorella vulgaris：production kinetics and thermodynamics[J].Aquaculture International，2012，20（3）：455～466.

[14]Merloni A，Dobrovolska O，Zambelli B，et al.Molecular landscape of the interaction between the urease accssory proteins UreE and UreG[J].Biochimica et biophysica acta-proteins and proteomics，2014，1844（9）：1662～1674.

[15]Raposo M，Morais R，Morais A，et al.Health applications of bioactive compounds from marine microalgae[J].Life sciences，2013，93（15）：479～486.

[16]Santos E O，Michelon M，Gallas J A.Raw Glycerol as Substrate for the Production of Yeast Biomass[J].International Journal of Food Engineering，2013，9（4）：413～420.

[17]Strope P K，Nickerson K W，Harris S D，et al.Molecular evolution of urea amidolyase and urea carboxylase in fungi[J].BMC evolutionary biology，2011，11：2～15.

[18]Thongkratok R，Khempaka S，Molee W.Protein Enrichment of Cassava Pulp Using Microorganisms Fermentation Techniques for Use as an Alternative Animal Feedstuff[J].Journal of Animal and Veterinary Advances，2010，9（22）：2859～2862.

[19]Tong L.Structure and function of biotin-dependent carboxylases[J].Cellular and molecular life，2013，70（5）：863～891.

[20]Vendruscolo F，Ribeiro C S，Esposito E.Protein Enrichment of Apple Pomace and Use in Feed for Nile Tilapia[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2009，152（1）：74～87.

[21]Watanabe T，Iefuji H，Kitamoto H K.Treatment of，and Candida utilis biomass production from shochu wastewater the effects of maintaining a low pH on DOC removal and feeding cultivation on biomass production[J].SpringerPlus，2013，2：514～521.

[22]Wang D，Wei G，Nie M.Effects of nitrogen source and carbon/nitrogen ratio on batch fermentation of gluta-thione by Candida utilis[J].Korean Journal of Chemical Engineering，2010，27（2）：551～559.

[23]Wang S P，BlachierF，Zhao F.Intestinalmicrobiota：Development，metabolism and functions[J].Journal of Food Agriculture&Environment，2011，9（2）：121～129.

[24]Zare F，Magnusson M，Bergstrom T.Uric acid，a nucleic acid degradation product，down-regulates dsRNA-triggered arthritis[J].Journal of Leukocyte Biology，2006，79（3）：482～488.

[25]Zhang Z Y，Jin，Bo B，Zhi H.Production of fungal biomass protein using microfungi from winery wastewater treatment[J].Bioresource Technology，2009，99（9）：3871～3876.