姜光麗， 何小琴， 郗存顯， 唐柏彬， 王國(guó)民*

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川成都 611130；2.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶渝中 400016；3.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶江北400020）

β-阻斷劑是指含氮激素的一類藥物，具有芳氧丙醇胺或苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核，苯環(huán)上連有堿性的側(cè)鏈，因側(cè)鏈上不同的取代基，分為不同的藥物。β-阻斷劑類藥物在臨床上常用于治療多種原因引起的心律失常、心絞痛及高血壓等 （楊寶峰等，2009），還作為動(dòng)物在運(yùn)輸中及屠宰前的鎮(zhèn)靜用藥（苗虹，2010）。過(guò)量使用該類藥物在動(dòng)物組織中會(huì)產(chǎn)生殘留，食用高殘留的動(dòng)物組織后可影響人類的健康（田蘭等，2013）。因此，進(jìn)行飼料中β-阻斷劑的監(jiān)測(cè)，防止在畜禽養(yǎng)殖及運(yùn)輸中非法或過(guò)量使用β-阻斷劑，對(duì)保障動(dòng)物源性產(chǎn)品的質(zhì)量安全非常必要。

目前β-阻斷劑類藥物的測(cè)定方法有流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法 （FI-CL）、毛細(xì)管電泳電化學(xué)法（CE-ECD）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、高效液相色譜法 （HPLC）、高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）等。測(cè)定的樣本基質(zhì)主要以肌肉、肝、腎等動(dòng)物源性食品、環(huán)境水樣、尿液等樣品為主，凈化手段主要采取固相萃取法（SPE）、分子印記技術(shù)（MIP）和固相微萃?。↙PME），其中 SPE是應(yīng)用最為廣泛的方法。由于HPLC-MS/MS可對(duì)多組分同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，且具有專屬性強(qiáng)、選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，因此對(duì)β-阻斷劑類藥物的分析主要采用此方法。但是，目前國(guó)內(nèi)有關(guān)飼料中多種β-阻斷劑藥物同時(shí)測(cè)定的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用先進(jìn)的QuEchERS凈化技術(shù)，通過(guò)優(yōu)化提取溶劑、吸附劑的種類和用量等影響因素，利用氘代同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，建立了一次提取、正離子模式掃描、UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定飼料中6種β-阻斷劑類藥物的新方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好、實(shí)用性強(qiáng)，為飼料中β-阻斷劑類藥物的定性定量分析提供了技術(shù)保障。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑 API4000QTRAP高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)ABsciex公司）；LC-30AD超高效液相色譜儀 （日本Shimadzu公司）；BS224S型天平（德國(guó)Sartorius公司）；渦旋振蕩混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；SR-2DS強(qiáng)力振蕩器（日本Taitec公司）；3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；N-EVAP116水浴式氮吹濃縮儀（美國(guó)Organomation Associates公司）。

6種標(biāo)準(zhǔn)品：卡拉洛爾、納多洛爾、阿替洛爾購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；艾司洛爾、卡維地洛購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；醋丁洛爾購(gòu)自美國(guó)USP公司；卡拉洛爾-D7購(gòu)自德國(guó)WITEGA公司，純度均≥98.0%。乙腈、甲醇、異丙醇、乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；乙醚（分析純，重慶川東化工集團(tuán)有限公司）；石墨化炭黑（GCB）吸附劑（美國(guó)Supelco公司）；丙基乙二胺（PSA） 、C18吸附劑（美國(guó)Agilent公司）；中性Al2O3（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水MgSO4（成都市科龍化工試劑廠）。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng) （美國(guó)Millipore公司）制備的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物適量，用甲醇配制成濃度為1.0 mg/mL和0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，-18℃保存。分別移取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容成濃度為0.5 mg/L的6種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存。吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，用30%乙腈水溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1～500 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每毫升該混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液含有同位素內(nèi)標(biāo)各20 ng，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：Acquity UPLCTMBEH C18柱 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A為乙腈，B為2 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸），梯度洗脫程序見(jiàn)表 1；流速：0.30 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：40 ℃。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子檢測(cè)模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；噴霧電壓5.5 kV；霧化氣壓力0.45 MPa；氣簾氣壓力0.21 MPa；輔助氣壓力0.41 MPa；離子源溫度550℃；碰撞室入口電壓為10 V。各個(gè)化合物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)（Q1/Q3）、碰撞室出口電壓（CXP）、碰撞電壓（CE）、去簇電壓（DP）等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)和保留時(shí)間

1.4 樣品前處理 稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中，加入0.2 μg/L混合內(nèi)標(biāo)溶液0.3 mL與15 mL乙腈-甲醇溶液（3∶7，V/V），混勻后，于振蕩器中振蕩提取20 min，6500 r/min離心5 min，移取上清液于另一個(gè)50 mL離心管中，殘留物重復(fù)提取1次，合并提取液，混勻后，移取10 mL提取液于50 mL離心管中，加入50 mg PSA和500 mg無(wú)水Mg-SO4，旋渦振蕩 2 min 后，8000 r/min 離心 5 min，轉(zhuǎn)移上清液于玻璃小試管中，于40℃水浴氮?dú)獯抵羶舾?，?.0 mL 30%乙腈溶液溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾系膜，供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化 流動(dòng)相的組成對(duì)化合物的分離及離子化效率至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、甲醇、乙酸銨等在流動(dòng)相體系中的配比對(duì)目標(biāo)物的分離及峰形的影響，實(shí)驗(yàn)表明，乙腈-2.0 mmol/L乙酸銨水溶液為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的響應(yīng)強(qiáng)度和分離度較好。同時(shí)結(jié)合甲酸可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值、保持離子強(qiáng)度和峰形良好等特點(diǎn)，優(yōu)化了溶液中甲酸的比例 （0.1%、0.2%、0.5%、0.8%和1.0%）及不同的梯度洗脫程序。結(jié)果表明，采用乙腈-2.0 mmol/L乙酸銨溶液（含0.2%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，在表1所示的梯度洗脫條件下，目標(biāo)物的峰形好且響應(yīng)強(qiáng)度最大，分離度和靈敏度較高。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 樣品提取條件的優(yōu)化 β-阻斷劑藥物具有相似的母核，但是環(huán)上的取代基不同使其各自的溶解性能不一致，根據(jù)其易溶于有機(jī)溶劑的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙腈-甲醇（7∶3，V/V）、甲醇-乙腈（7∶3，V/V）對(duì)目標(biāo)物的提取效率。從圖 1 可見(jiàn)，采用乙腈-甲醇（3∶7，V/V）溶液提取時(shí)，提取回收率均較高。因此，選用乙腈-甲醇（3∶7，V/V）溶液作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對(duì)6種β-阻斷劑藥物回收率的影響

2.2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化 研究比較了固相萃取柱與QuEchERS吸附劑法的凈化效果和回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固相萃取柱的加標(biāo)回收率均不理想，且重現(xiàn)性較差；QuEchERS吸附劑法取得了較好的凈化效果。因此，本研究采用QuEchERS吸附劑法對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

實(shí)驗(yàn)分別考察了PSA、C18、中性氧化鋁、石墨化炭黑（GCB）及無(wú)水MgSO4等吸附劑對(duì)目標(biāo)物的吸附情況，發(fā)現(xiàn)C18和GCB對(duì)目標(biāo)物的吸附較強(qiáng)，而PSA、中性氧化鋁和無(wú)水MgSO4對(duì)大多數(shù)目標(biāo)物吸附較少。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了PSA、中性氧化鋁的凈化效果，發(fā)現(xiàn)PSA的凈化效果較好。因此，實(shí)驗(yàn)選用PSA、無(wú)水MgSO4作為吸附劑。

根據(jù)提取液中脂肪、糖分及水分的含量特點(diǎn)，考察了無(wú)水MgSO4和PSA吸附劑對(duì)凈化效果的影響，無(wú)水MgSO4僅僅起吸水的作用，實(shí)驗(yàn)表明，500 mg無(wú)水MgSO4能夠完全吸附提取液中的水分，且對(duì)樣品凈化效果和回收率的影響均不大，在固定加入500 mg無(wú)水MgSO4的情況下，優(yōu)化了PSA的用量對(duì)樣品凈化和回收率的影響（圖2）。實(shí)驗(yàn)最終選用50 mg PSA及500 mg無(wú)水MgSO4為凈化劑組合，樣品溶液澄清，基質(zhì)干擾較小，回收率最佳。

圖2 PAS吸附劑用量對(duì)回收率的影響

2.2.3 定容溶劑的選擇 實(shí)驗(yàn)以流動(dòng)相乙腈溶液為定容溶劑，考察了不同比例的乙腈溶液 （0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%） 對(duì)樣品殘?jiān)心繕?biāo)物的溶解性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著溶劑中乙腈比例的增大，溶解效率相應(yīng)增大，雜質(zhì)相應(yīng)增多，并且部分目標(biāo)物出現(xiàn)峰分叉；當(dāng)乙腈比例小于30%時(shí)，卡維地洛的溶解性較差，基本無(wú)回收率。綜合考慮，選擇以30%乙腈溶液定容，能使目標(biāo)物充分溶解，且雜質(zhì)較少，峰形較好。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性方程、檢出限及定量限 準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用30%乙腈溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在最優(yōu)條件下測(cè)定。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，待測(cè)物的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。由表3可知，6種β-阻斷劑藥物濃度為1.0～500.0 μg/L時(shí)，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于或等于0.9990。

表3 6種β-阻斷劑藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

在空白樣品中，分別添加15 μg/kg的6種β-阻斷劑藥物，按照1.4中的方法進(jìn)行樣品處理后用UPLC-MS/MS分析。以信噪比（S/N≥3）和信噪比（S/N≥10）計(jì)算該方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.02～0.16 μg/kg和0.07～0.54 μg/kg。

2.3.2 方法的回收率和精密度 在空白飼料中，分別按照 5.0、10.0、20.0 μg/kg 3 個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行做6份，按照1.4中的方法進(jìn)行樣品處理后經(jīng)UPLC-MS/MS分析，計(jì)算平均回收率與RSD。6種β-阻斷劑藥物的總體回收率為81.8% ～119.6%，RSD為4.8%～11.3%（表4）。

表4 6種β-阻斷劑藥物在飼料中的平均回收率和精密度（n=6） %

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè) 按照本研究建立的方法分別對(duì)市場(chǎng)上的豬配合飼料、豬預(yù)混合飼料各5個(gè)樣品進(jìn)行分析，均未檢出卡拉洛爾、納多洛爾、阿替洛爾、艾司洛爾、卡維地洛、醋丁洛爾等6種β-阻斷劑藥物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)將QuEchERS凈化技術(shù)應(yīng)用于飼料中6種β-阻斷劑藥物的測(cè)定，通過(guò)優(yōu)化吸附劑的類型及用量，確定出最優(yōu)的凈化方案，有效去除基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾。試驗(yàn)建立的飼料中阿替洛爾、納多洛爾、醋丁洛爾、艾司洛爾、卡拉洛爾、卡維地洛6種β-阻斷劑類藥物的UPLC-MS/MS測(cè)定方法簡(jiǎn)單、快捷，具有較好的應(yīng)用前景。

[1]苗虹.食品及生物材料中β-激動(dòng)劑和β-阻斷劑殘留檢測(cè)技術(shù)研究及污染評(píng)價(jià)：[博士學(xué)位論文][D].中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，2010.

[2]田蘭，張繼春，陳睿，等.超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法檢測(cè)鎮(zhèn)靜安神類中藥制劑及保健品中非法添加的9種化學(xué)藥品 [J].中國(guó)藥業(yè)，2013，22（6）：66 ～ 68.

[3]楊寶峰，蘇定馮，周宏源.藥理學(xué)（第7版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009.101.