郭曉軍， 郭 威， 袁洪水， 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

脂肪酶，即甘油酯水解酶，在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，能有效地促進(jìn)畜禽對脂肪的消化，同時(shí)還可提供一些畜禽生長過程中必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如脂肪分解代謝產(chǎn)生的不飽和脂肪酸等（劉德海等，2012）。 Dierick 等（2004）試驗(yàn)表明，部分中鏈脂肪酸能明顯抑制部分消化道有害微生物的生長，改善腸道菌落環(huán)境，從而促進(jìn)消化，起到類似抗生素的作用。脂肪酶存在于動(dòng)植物和微生物中，以微生物中最多，并且微生物脂肪酶比動(dòng)植物脂肪酶具有更強(qiáng)的酸堿耐受性和溫度適應(yīng)性 （張樹政，1984），尤其芽孢桿菌還具有較強(qiáng)抗逆性、易生產(chǎn)、易保存等優(yōu)點(diǎn)（彭立鳳，1999）。本研究擬從富含油脂的土樣中篩選具有高產(chǎn)脂肪酶活性的芽孢桿菌，并對其進(jìn)行紫外線誘變選育，以期擴(kuò)大微生物脂肪酶飼料添加劑的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 富含油脂的土樣10份，采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)附近餐廳、屠宰場。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 富集培養(yǎng)基（100 mL）：（NH4）2SO40.1 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.1g，橄欖油1mL，pH7.0，121℃滅菌 15min。

溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基 （100 mL）：（NH4）2SO40.2 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，Na2HPO40.1 g，瓊脂 1.5 g，pH 7.0，121 ℃滅菌 15 min。

三丁酸甘油脂培養(yǎng)基：用2%的聚乙烯醇溶液與三丁酸甘油酯以1∶9比例混合制成乳化液，再將乳化液與pH 8.0的Tris-HCl溶液以1∶9比例混合均勻，加入1.5%瓊脂，121℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖 2 g，蛋白胨2.5 g，橄欖油 1 mL，（NH4）2SO40.5 g，MgSO40.05 g，K2HPO40.1 g，pH 7.0，115 ℃蒸汽滅菌 30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）：葡萄糖 0.6 g，蛋白胨2 g，橄欖油 1 mL，（NH4）2SO40.1 g，MgSO40.05 g，K2HPO40.1 g，pH 7.0，115 ℃蒸汽滅菌 30 min。

菌株生理生化鑒定試劑參見 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的初篩 取10份土樣各取1 g分別溶于10 mL無菌水中，80℃水浴30 min，然后取1 mL混懸液加入到富集培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng) 2 d。

取1 mL富集培養(yǎng)液用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，然后取 10-7、10-6、10-5三個(gè)稀釋度液各 100 μL涂布于溴甲酚紫顯色培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后觀察菌落周圍形成黃色溶解圈情況。挑選產(chǎn)生黃色溶解圈明顯的菌落于NA平板上“之”字劃線純化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接NA斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)備用。

1.2.2 產(chǎn)脂肪酶芽孢桿菌的復(fù)篩 取少許37℃斜面活化菌，接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)18 h，然后以9%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、150 r/min培養(yǎng)3 d。取1.5 mL發(fā)酵液，4℃、12000 r/min離心10 min。將已滅菌的牛津杯輕輕放置在三丁酸甘油酯平板上，然后注入100 μL上清液。37℃恒溫放置10～12 h，測量水解圈直徑并記錄。

1.2.3 脂肪酶活力測定 脂肪酶活力測定方法參見橄欖油乳化法（Macrae 和 Hammond，1985）。

1.2.4 菌株的鑒定 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定與生理生化鑒定參照 《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）。菌株16S rDNA分子生物學(xué)鑒定方法參見王偉（2014）菌種鑒定方法。

1.2.5 菌株紫外誘變 對數(shù)生長期的培養(yǎng)液，無菌水梯度稀釋至10-5，在18 W紫外燈下分別照射30、60、90、120、180、240、300 s， 照射完 4 ℃避光放置1～2 h，然后在紅光下涂布初篩培養(yǎng)基，避光培養(yǎng)1～2 d。挑選周圍有黃色溶解圈且形態(tài)不同的菌落，接種種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)16～18 h，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、150 r/min培養(yǎng)3 d，平板擴(kuò)散法測定酶活力大小。將脂肪酶活力最高的誘變菌株連續(xù)傳代5代培養(yǎng)后測定酶活力，以檢測其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選 本試驗(yàn)采用溴甲酚紫顯色法初篩，得到56株產(chǎn)脂肪酶菌株。三丁酸甘油酯平板法復(fù)篩，優(yōu)選出11株具有較高脂肪酶活性的菌株。采用橄欖油乳化法測定酶活力，菌株3EA1-1酶活力最高，達(dá)36.1 U/mL。

2.2 菌株3EA1-1的鑒定

2.2.1 菌落和菌體形態(tài)特征 觀察菌株3EA1-1在NA培養(yǎng)基中生長24 h的菌落形態(tài)。菌落成乳白色，個(gè)體適中，形狀不規(guī)則，不透明，邊緣呈微鋸齒狀，表面干燥，無褶皺，無凸起。菌株經(jīng)結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，菌體呈桿狀散在或成串分布，革蘭氏染色呈陽性，芽孢呈橢圓形，中生。

2.2.2 16S rDNA分子生物學(xué)鑒定 經(jīng)測序，菌株3EA1-1的16S rDNA序列長1444 bp，與Gen-Bank中所有已測定的原核生物的16S rDNA序列進(jìn)行比對，選擇9株相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。結(jié)果顯示，供試菌株3EA1-1屬于芽孢桿菌屬，且與參比菌株Bacillus subtilis subsp.Subtilis和Bacillus tequilensis聚到了一起。

圖1 菌株3EA1-1 16s rDNA基因進(jìn)化樹

2.2.3 生理生化試驗(yàn) 在分子生物學(xué)鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 芽孢桿菌3EA1-1生理生化特性

結(jié)合供試菌株3EA1-1的形態(tài)特征、16S rDNA序列分析及生理生化特性，對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，確定該菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 菌株3EA1-1的紫外誘變 由圖2可見，紫外誘變后挑選菌落形態(tài)差異較大的菌株進(jìn)行三丁酸甘油酯平板檢測，30 s和60 s出現(xiàn)正突變菌株較多，其中照射30 s得到的一株突變株比出發(fā)菌株脂肪酶活力提高了40%，命名為EA-30-A。經(jīng)5次傳代試驗(yàn)，酶活力較傳代前降低2.27%（P＞0.05），證明該菌株的遺傳穩(wěn)定性良好，是一株比較理想的脂肪酶產(chǎn)生菌。

圖2 3EA1-1突變菌株復(fù)篩結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用溴甲酚紫顯色法初篩，三丁酸甘油酯平板法復(fù)篩得到11株產(chǎn)脂肪酶較高的菌株。采用橄欖油乳化法對溶解圈較大的菌株進(jìn)行酶活力測定，得到一株酶活力較高的菌株3EA1-1，酶活力達(dá)到36.1 U/mL。結(jié)合該菌株的菌落形態(tài)、菌體特征、生理生化試驗(yàn)結(jié)果和16S rDNA序列分析結(jié)果，鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。并采用UV對其進(jìn)行單因子誘變，經(jīng)三丁酸甘油酯平板篩選，選育出了一株產(chǎn)脂肪酶活性高的菌株EA-30-A，其酶活力較原菌株提高了40%。同時(shí)通過傳代試驗(yàn)，證明菌株的遺傳穩(wěn)定性良好。

[1]東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].科學(xué)出版社，2001.

[2]劉德海，解復(fù)紅，賈彬，等.脂肪酶及其在飼料中的作用[J].中國飼料，2012，16：31 ～ 33.

[3]彭立鳳.微生物脂肪酶的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，1999，2：17～22.

[4]王偉，王世英，郭曉軍，等.β-葡聚糖酶產(chǎn)生菌的分離、篩選及鑒定[J].中國飼料，2014，5：17 ～ 20.

[5]張樹政.酶制劑工業(yè)（下）[M].北京：科學(xué)出版社，1984.

[6]Dierick N，Michiels J，Van Nevel C.Effect of medium chain fatty acids and benzoic acid，as alternatives for antibiotics，on growth and some gut parameters in piglets[J].Communications in agricultural and applied biological sciences，2004，69（2）：187 ～ 190.

[7]Macrae A R，Hammond R C.Present and future applications of lipases[J].Biotechnology&genetic engineering reviews，1985，3：193 ～ 217.