烏骨藤提取物對MKN-45大鼠人原位胃癌模型腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及環(huán)氧合酶-2表達的影響

陳軼陳益耀林誠

(海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，海南?？?70311)

摘要〔〕目的探討烏骨藤提取物對MKN-45大鼠人原位胃癌模型腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及環(huán)氧合酶(COX)-2表達的影響。方法健康雄性裸大鼠，共24只，隨機分為：烏骨藤組、西藥組和對照組，收集體外培養(yǎng)生長處于對數(shù)期的MKN-45胃癌細胞，注射于裸大鼠近腋部皮下，當皮下移植瘤長至直徑約1 cm左右時，取裸大鼠癌瘤組織，植入大鼠胃大彎的血管豐富處建立模型，于造模72 h后，對照組給予生理鹽水灌胃，西藥組和烏骨藤組分別給予塞來昔布和烏骨藤水提物灌胃，每次0.5 ml/10 g，1次/d。連續(xù)30 d。分別在給藥第15天和第30天各處死半數(shù)裸鼠，檢測癌瘤的生長，肝臟及腸系膜轉(zhuǎn)移情況，Western印跡法檢測胃黏膜組織COX-2蛋白表達。結(jié)果各組癌瘤重量和體積均隨著時間的增加而不同程度的增長，與對照組相比，西藥組和烏骨藤組的癌瘤重量和體積增長均顯著減慢(P<0.05)，與西藥組相比，烏骨藤組對于癌瘤增長的控制作用更為顯著(P<0.05)，各藥物組抑瘤率均顯著高于對照組(P<0.05)，與西藥組相比，烏骨藤組的抑瘤率更高(P<0.05)。治療15 d時，各組均未見腸系膜轉(zhuǎn)移，僅對照組見肝臟轉(zhuǎn)移。治療30 d時，各組均見肝臟及腸系膜轉(zhuǎn)移。各治療組與對照組相比，肝臟及腸系膜轉(zhuǎn)移數(shù)均顯著減少，與西藥組相比，烏骨藤組癌瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)減少的更為明顯(P<0.05)。經(jīng)藥物治療后，治療后15 d，30 d各治療組COX-2蛋白水平均顯著降低，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，與西藥組相比，烏骨藤組的COX-2蛋白水平下降更為明顯(P<0.05)。結(jié)論烏骨藤提取物抑制MKN-45大鼠人原位胃癌模型腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及COX-2表達具有明顯的改善作用。

關(guān)鍵詞〔〕烏骨藤提取物；胃癌；環(huán)氧合酶-2

中圖分類號〔〕R285〔文獻標識碼〕A〔

第一作者：陳軼(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤基礎與臨床研究。

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類健康〔1，2〕。在原位癌的治療中天然藥物的地位日益重要。因此尋找中藥抗腫瘤活性成分成為研究的重點。烏骨藤為番荔枝科植物白葉瓜馥木的根〔3〕。據(jù)《中藥大辭典》記載：烏骨藤性辛，味溫，入肝經(jīng)，具有消炎，清熱解毒，散結(jié)止痛等功效〔4〕。現(xiàn)代藥理提示烏骨藤含有多種甾體酯苷、有機酸、多糖等化學成分，其中C21甾體苷和多糖成分具抗腫瘤活性〔5〕，對多種惡性腫瘤細胞有明顯的抑制作用，曾用于治療多種消化系統(tǒng)腫瘤，收獲了較好的療效。但對于烏骨藤提取物對于原位胃癌的治療作用研究尚少。本文觀察烏骨藤提取物對原位胃癌的生長、轉(zhuǎn)移及環(huán)氧合酶(COX)-2表達的干預作用。

1資料與方法

1.1實驗動物健康雄性裸大鼠，8～10周齡，體重200～230 g，共24只，由北京維通利華實驗動物中心提供。裸大鼠及實驗條件達到SPF。室溫20℃～22℃，濕度50%～70%，自由進食、水。

1.2儀器及試劑人胃癌細胞株MKN-45(上海仁濟醫(yī)院)；烏骨藤水提物；塞萊昔布膠囊(西樂葆，輝瑞制藥有限公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；25%胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；水合氯醛；COX-2 抗體(Abcam公司)。

1.3實驗方法

1.3.1模型的建立裸大鼠禁食12 h，經(jīng)10% 水合氯醛麻醉，用75%酒精消毒裸大鼠腹部皮膚，收集體外培養(yǎng)生長處于對數(shù)期的MKN-45胃癌細胞，配制成單細胞懸液，1×107個/ml，用2 ml注射器抽取2 ml，于裸大鼠近腋部皮下進針，回抽無血，緩慢注射后迅速拔針，當皮下移植瘤長至直徑約1 cm 左右時，取裸大鼠癌瘤組織，腹正中切口約1 cm，在胃大彎的血管豐富處，將備好的腫瘤組織塊植入其中，進行縫合。見大鼠出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、反應遲鈍、活動減少等現(xiàn)象，且胃部出現(xiàn)可觸及的癌瘤，證明造模成功。

1.3.2分組及處理實驗動物隨機分為：烏骨藤組、西藥組和對照組，每組8只裸鼠，于造模72 h后開始給藥。對照組給予生理鹽水灌胃，每次0.5 ml/10 g，西藥組組和烏骨藤組分別給予塞來昔布和烏骨藤水提物灌胃，均為每次0.5 ml/10 g，1次/d。連續(xù)30 d。分別在給藥第15天和第30天各處死半數(shù)裸鼠，檢測相應指標。

1.4檢測指標及觀察方法

1.4.1癌瘤生長情況在給藥第15天和第30天各處死半數(shù)裸鼠，剝?nèi)×鰤K，用電子天平稱量移植瘤體的質(zhì)量，計算抑瘤率。測量腫瘤大小、計算腫瘤體積。

1.4.2癌瘤轉(zhuǎn)移情況分別在第15天和第30天處死裸鼠，打開腹腔觀察癌瘤轉(zhuǎn)移情況，肉眼下計數(shù)肝臟及腸系膜表面的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，比較各組胃癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個數(shù)。

1.4.3COX-2 的測定用Western印跡法，將勻漿提取的蛋白經(jīng)變性處理。再行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入COX-2 的一抗(1∶500)，孵育成功后，加入二抗后(1∶2 000)，室溫下孵育后，每張膜加1∶1的發(fā)光液1 ml，化學發(fā)光法顯影，掃描條帶后，上機分析。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0進行t檢驗及χ2檢驗。

2結(jié)果

2.1各組大鼠的癌瘤生長情況各組癌瘤重量和體積均隨時間的增加而不同程度的增長，經(jīng)藥物干預后，癌瘤的重量和體積均得到了抑制，與對照組相比，西藥組和烏骨藤組的癌瘤重量和體積增長均顯著減慢(P<0.05)，與西藥組相比，烏骨藤組對于癌瘤增長的控制作用更為顯著(P<0.05)，各藥物組抑瘤率均顯著高于對照組(P<0.05)，與西藥組相比，烏骨藤組的抑瘤率更高(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠癌瘤生長情況比較( ± s， n=4)

與對照組同時點比較：1)P<0.05；與西藥組同時點比較：2)P<0.05，下表同

2.2各組大鼠的癌瘤轉(zhuǎn)移情況兩組裸大鼠在肝臟、腸系膜等部位也可見腫瘤結(jié)節(jié)，灰白色，大小不等。治療15 d時，各組均未見腸系膜轉(zhuǎn)移，僅對照組見肝臟轉(zhuǎn)移。治療30 d時，各組均見肝臟及腸系膜轉(zhuǎn)移。各治療組與對照組相比，肝臟及腸系膜轉(zhuǎn)移數(shù)均顯著減少，與西藥組相比，烏骨藤組癌瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)減少的更為明顯(P<0.05)，見表2。

表2　各組大鼠轉(zhuǎn)移病灶數(shù)

2.3各組大鼠胃黏膜組織COX-2蛋白水平比較經(jīng)藥物治療后，治療后15 d，30 d各治療組COX-2蛋白水平均顯著降低(P<0.05)，與西藥組相比，烏骨藤組的COX -2蛋白水平下降更為明顯(P<0.05)。見表3，圖1。

表3　各組大鼠COX-2蛋白水平比較

圖1　各組大鼠胃黏膜組織COX-2蛋白表達

3討論

隨著人民生活水平的不斷提高，胃腸道惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的主要疾病之一，我國胃癌發(fā)病人數(shù)占全世界發(fā)病總數(shù)的42%〔6〕，并有逐年上升的趨勢，并且胃癌的發(fā)病年齡有年輕化的趨勢，胃的原位癌是胃癌的前期表現(xiàn)，因此，原位癌的早期診斷和治療對于胃癌的診斷和治療個非常重要，直接影響到患者的長期生存率。COX是前列腺素合成過程中重要的限速酶〔7〕。正常胃黏膜COX-2表達很低甚至不能測出，在病理情況下，COX-2的高表達通過抑制細胞凋亡、促進新生血管的形成及幫助腫瘤細胞逃逸機體免疫監(jiān)視等多種作用促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展〔8〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 高表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此許多研究已把COX-2作為治療胃癌的靶點。胃癌組織中COX-2的表達遠高于正常胃黏膜〔9〕。它的表達延長了癌細胞的生存期，有利于癌細胞發(fā)生浸潤與轉(zhuǎn)移。大部分研究認為COX-2與浸潤深度以及病理分期有關(guān)〔10〕。還有一些研究認為其與腫瘤大小有關(guān)〔11〕。因此，COX-2的過表達可能誘導胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)代藥理研究表明：烏骨藤中所含的C21 甾體苷、三萜和多糖是其抗腫瘤作用的主要活性物質(zhì)。烏骨藤提取物對多種腫瘤細胞均有抑制作用〔12〕，但對于烏骨藤提取物對于原位胃癌的治療作用研究尚少，為了減輕患者痛苦，改善其預后，筆者做了以上研究。

本研究表明藥物治療可以有效地抑制原位胃癌的增長，可以有效地抑制癌瘤組織的轉(zhuǎn)移，且烏骨藤水提物的效果更好。表明藥物能夠降低COX -2水平，且烏骨藤水提物的效果更優(yōu)，從而抑制腫瘤的增生和轉(zhuǎn)移，與之前的研究結(jié)果相符。

總之，烏骨藤提取物抑制MKN-45大鼠人原位胃癌模型腫瘤生長、轉(zhuǎn)移及COX-2表達具有明顯的改善作用，對臨床有指導意義，值得臨床推廣。

4參考文獻

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〔2013-12-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)