Ad-HGF轉染LMC培養(yǎng)上清液對大鼠大腦動脈內皮細胞的作用

丁紀超劉旻張曉鑫李彤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一臨床學院，河南新鄉(xiāng)453000)

摘要〔〕目的探討Ad-HGF轉染大鼠腦膜間皮細胞(RMMCs)得到的細胞培養(yǎng)上清液促腦血管新生的分子調控及相關作用。方法無菌條件下取出生1～2 d SD大鼠的腦組織，采用機械吹打、輕消化法結合組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)大鼠腦動脈內皮細胞，傳3代后，通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，普通光學顯微鏡觀察細胞HE染色、第Ⅷ因子相關抗原、細胞免疫熒光染色等三方面進行細胞鑒定；通過MTT法檢測Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液對細胞增殖能力的影響；通過 Transwells法檢測對細胞遷移能力的影響；通過免疫印跡(WB)法檢測CAEC中TGF-β1蛋白表達情況。結果Transwells細胞遷移實驗見PVPE膜上大量被結晶紫染色的CAEC；隨機選取100倍視野下細胞遷移的數(shù)量進行比較，實驗組與對照組有顯著性差異(P<0.05)；MTT法發(fā)現(xiàn)，實驗組與對照組也有顯著性差異(P<0.05)；同一時間點，隨著Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及外源性HGF濃度增加，CAEC中TGF-β1平均光密度值逐漸降低，TGF-β1平均光密度值呈一定量相關性，差異有顯著性(P<0.05)。結論采用機械吹打、胰酶消化法結合組織塊培養(yǎng)法可以成功獲取高純度大鼠CAEC；Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液具有促進大鼠CAEC增殖和遷移的作用；Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及HGF具有抑制CAEC中TGF-β1蛋白表達的作用。

關鍵詞〔〕肝細胞生長因子；腦動脈內皮細胞；血管新生；基因治療；神經保護

中圖分類號〔〕R39〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：河南省自然科學基金資助項目(112101310400)；河南省科技廳資助項目(082102310015)

通訊作者：李彤(1963-)，女，博士，碩士生導師，主要從事腦血管病研究。

第一作者：丁紀超(1986-)，男，在讀碩士，主要從事腦血管疾病的綜合治療與基礎研究。

大腦動脈內皮細胞(CAEC)是構成血腦屏障的主要成分，具有活躍的分泌、合成、代謝及免疫功能，可產生多種細胞因子和生物活性物質，參與調節(jié)機體的生理活動，是各種生理、病理因素的靶細胞。肝細胞生長因子(HGF)為一獨立的促血管生成因子，具有神經營養(yǎng)、促軸突發(fā)生〔1〕、血管發(fā)生、減少膠質瘢痕合成〔2〕以及促進腦室管膜下區(qū)相關神經細胞的增殖、分化作用〔3〕。TGF-β1為調控血腦屏障完整性的重要因子，與HGF相互作用的效應因為細胞、細胞環(huán)境及細胞內主要活性因子不同而不同，尤其對神經膠質化的調控HGF-TGF-β1平衡具有重要作用。本課題前期實驗結果顯示，Ad-HGF可以顯著減少治療組大鼠腦組織TGF-β1的表達，隨著HGF的表達量增加TGF-β1的表達下降，表明Ad-HGF可能通過抑制TGF-β1的表達促進血管新生，減少腦缺血引起的神經損傷。本實驗期望為明確Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液對大鼠CAEC是否具有促血管新生作用提供實驗基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器出生1～2 d健康Sprague-Dawley(SD)大鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液來自河南省神經病學研究所DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Hyclone)、胰蛋白酶(Gibco)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢博士德)、D-Hank液(Gibco)、二甲基亞砜(DMSO)(Amersham)、臺盼藍(Sigma)、噻唑蘭(MTT)、SERVAFITC標記的羊抗兔IgG(武漢博士德)、兔抗大鼠第Ⅷ因子相關抗原抗體(Rabbit Anti-factor Ⅷ)，(北京博奧森DAB顯色試劑盒)、HGF(h)武漢博士德、ELISA kit(96T)(武漢博士德)、封閉用山羊血清(武漢博士德)，其余試劑均為市售國產分析純試劑。

純化水系統(tǒng)(Dlamond RO型)、Thermo Scientific超純水器(NANOpure Dlamond型)、Thermo Scientific電子分析天平(TE612-L型)(Sartoulus)、超凈工作臺(SW-CJ-2FD型)(蘇州安泰空氣技術有限公司)、倒置相差顯微鏡(TS100-F型)(日本Nikon)、免疫熒光顯微鏡(ECLIPSE 55i型)(日本Nikon)、CO2細胞培養(yǎng)箱(371高溫滅菌型)(Thermo Scientific)、超低溫冰箱(Thermo Forma型)、全自動滅菌柜(HVE-50型)(Thermo Scientific)，日本Hiayama低溫高速離心機(CL31R型)、Thermo Scientific低速離心機、北京廣安醫(yī)療器械廠微量可調加樣器(Thermo Forma型)、Thermo Scientific恒溫干燥箱、(DHG-9140型)電熱恒溫水溫箱、Thermo Scientific臺式精密PH計(MODEL818型)、Thermo Orion Z-C恒溫振蕩器、酶標儀(MK3型)、Thermo Scientific細胞培養(yǎng)瓶、美國Coning細胞凍存管、Transwells細胞遷移板(美國Costar)。

1.2細胞培養(yǎng)及鑒定無菌條件下取出生1～2 d SD大鼠腦組織，采用機械吹打、輕消化法結合組織塊培養(yǎng)法〔4〕原代培養(yǎng)大鼠腦動脈內皮細胞，傳3代后，通過倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，普通光學顯微鏡觀察細胞HE染色、第Ⅷ因子相關抗原、細胞免疫熒光染色等三方面進行細胞鑒定。

1.3HGF及Ad-HGF感染LMC上清液對CAEC細胞增殖的影響體積分數(shù)0.125%胰蛋白酶-EDTA消化CAEC細胞后，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，將細胞濃度調整為5×107/L。實驗分3組：第一組為空白組，不添加HGF及Ad-HGF感染LMC上清液，取96孔板，每天在固定時間增設4個復孔，放入溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液一次。第2組為添加HGF組，取96孔板，每天在固定時間增設4個復孔，并加入等量100 ng/L濃度的HGF，放入溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液一次。第3組為Ad-HGF感染LMC上清液組，取96孔板，每天在固定時間增設4個復孔，并加入相同效應的Ad-HGF感染LMC上清液，放入溫箱中培養(yǎng)，每隔3 d換液一次。7 d后，在同一時間取出96孔板，每組取4個孔均吸棄培養(yǎng)液后，每孔加MTT 20 μl(實驗組、對照組每孔滴加MTT前用PBS輕輕沖洗2遍以減少誤差)，放入37℃溫箱孵育4 h，小心吸棄孔內MTT，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min使紫色結晶物甲瓚充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀選擇570 nm波長測定各孔吸光度值。

1.4遷移實驗取1塊Transwell小室的24孔板，每3個小室為1組，分為實驗組(加入Ad-HGF感染LMC上清液)和對照組(空白組)。將CAEC細胞用含胎牛血清蛋白(10 g/L)的DMEM培養(yǎng)基重懸，調整濃度為3×108/L。 每個小室加入100 μl的細胞懸液，在小室下方的孔內，每個孔加入600 μl含體積10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。小室內再加入HGF含量為100 ng/ml濃度的Ad-HGF感染LMC上清液1 ml，將6個小室置于溫箱中孵育16 h后，每個小室及下室加入體積分數(shù)4%多聚甲醛共1 ml，固定細胞5 min，然后加入體積分數(shù)100%甲醛1 ml，在室溫下通透細胞20 min，再加入姬姆薩染液1 ml，細胞染色15 min，吸棄姬姆薩染液并用PBS洗滌2遍，用棉簽輕輕擦去聚碳酸酯膜上層細胞，光鏡100倍下每孔按上、中、下、左、右攝取5張照片，計數(shù)并組遷移細胞數(shù)。

1.5免疫印跡(WB)實驗隨機設定不同濃度HGF組及Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組，在同一時間點通過WB法檢測CAEC中TGF-β1蛋白表達情況。體積分數(shù)0.125%胰蛋白酶-EDTA消化CAEC細胞后，用含體積分數(shù)20%胎牛血清的DMEM重懸細胞，將重懸的細胞按2∶5傳代至5個培養(yǎng)皿中，為HGF組分別編號為a1、b1、c1、d1、e1。細胞濃度為1.7×105/ml，每皿細胞數(shù)為6.8×105/L，設定a1為空白對照組，其他各組加入外源性HGF濃度依次為10、20、40、80 ng/ml。同樣方法設Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組，分別編號為a2、b2、c2、d2、e2，a2為空白對照組，其他各組加入等效Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液。用含20%胎牛血清的培養(yǎng)液將每皿中的培養(yǎng)液體積調整為13 ml。置于37℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。取出10個CAEC細胞培養(yǎng)皿，PBS沖洗兩遍，用RIPA細胞裂解液裂解細胞，提取總蛋白。用BCA法行總蛋白定量。采用5%濃縮膠和10%分離膠行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為100 V，電泳總時間約為2 h。將凝膠中的蛋白質轉移至PVDF膜，PVDF膜位于陽極側，凝膠位于陰極側，采用150 mA電流，電轉1.5 h。用5%的脫脂奶粉對轉有蛋白條帶的膜進行封閉1.5 h，洗膜后分別與1∶200兔抗鼠TGF-β1、1∶200兔抗鼠GAPDH抗體4℃孵育過夜，洗膜后加入1∶4 000羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h。再次洗膜。轉移至暗室中，將PVDF膜上的TBST液用吸水慮紙吸出，置于干凈的培養(yǎng)皿中，取等量的超敏ECL化學發(fā)光即用型底物A液及B液混勻，將其滴加膜上，放入暗盒中曝光。用Quantity One軟件分析，以相應蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

2結果

2.1CAEC細胞形態(tài)及鑒定通過倒置相差顯微鏡觀察大鼠腦動脈內皮細胞，培養(yǎng)48 h換液后，可見大量細胞從動脈血管段游出，呈短梭形或多角形。培養(yǎng)9 d，可見細胞鋪滿培養(yǎng)孔，形成典型的“鋪路石”樣外觀，細胞大小、形狀較為均一，融合度達80%以上，見圖1。原代細胞培養(yǎng)9 d 后，細胞鋪滿瓶底行消化傳代，經傳代的第3代細胞用于鑒定，HE染色，細胞呈短梭形或多角形，大小不等，細胞質豐富，薄染為淡紅色，著色均勻，見圖2。在熒光倒置顯微鏡下觀察，傳代細胞核周圍的胞質內均出現(xiàn)黃綠色熒光，即第Ⅷ因子抗原陽性(見圖3)，陽性率達90%，胞質與胞核界限明顯，而對照細胞不染色(陰性)。

圖1　組織塊培養(yǎng)法CAEC細胞形態(tài)結構(×100)

圖2　CAEC細胞形態(tài) (HE染色，×100)

圖3　細胞間接免疫熒光染色法鑒定RMMCs(×200)

2.2MTT實驗結果實驗組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，見圖4。

2.3Transwells細胞遷移實驗見PVPE膜上大量被結晶紫染色的CAEC；隨機選取100倍視野下細胞遷移的數(shù)量進行比較，實驗組與對照組相比差異顯著(P<0.001)，見圖5。

2.4WB結果如圖6，圖7所示，同一時間點，隨著Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及外源性HGF濃度增加，CAEC中TGF-β1蛋白表達平均光密度值逐漸降低，隨著時間增加，同一濃度的Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液及外源性HGF，CAEC中TGF-β1蛋白表達平均光密度值逐漸增加，TGF-β1平均光密度值呈一定量相關性，HGF組同一濃度不同時間點差異顯著(P<0.001)，Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組同一濃度不同時間點差異顯著(P<0.001)，HGF組及Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液同一濃度相同時間點差異顯著(P<0.001)。

圖4　加入HGF及Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液 不同時間作用于CAEC后細胞活力變化

A為對照組，PVPE膜上很少見遷移出來的CAECs；B為實驗組，PVPE膜上可見大量被結晶紫染色的遷移出來的CAECs 圖5　Transwells細胞遷移實驗(×100)

A：正常組;B～E：HGF 10、20、40、80 ng/L組 圖6　HGF組不同時間點TGF-β1蛋白表達

A：正常組;B～E：Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液組，含HGF分別為10、20、40、80 ng/L 圖7　Ad-HGF感染LmC培養(yǎng)上清液組TGF-β1蛋白表達

3討論

本實驗表明采用機械吹打、胰酶消化法結合組織塊培養(yǎng)法可以成功獲取高純度大鼠腦動脈內皮細胞。Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液具有促進大鼠腦動脈內皮細胞增殖和遷移的作用。相比于HGF，Ad-HGF可以顯著減少CAEC中TGF-β1蛋白表達，且隨著Ad-HGF的濃度增加，TGF-β1蛋白表達下降，表明Ad-HGF感染LMC培養(yǎng)上清液可能通過表達HGF及其他增效因子間接抑制了TGF-β1的表達量，促進了CAEC的增殖。

HGF基因療法對于缺血性腦血管病的基因轉移載體包括腺病毒、脂質體、單純皰疹病毒等。本實驗課題選擇E1、E3缺失的Ad-HGF，避免了野生型腺病毒的復制產生。前期實驗針對腺病毒治療的安全性問題我們進行了相關預實驗，結果顯示腺病毒載體僅在給藥局部表達，持續(xù)2 w左右，使其在臨床應用中更加安全。HGF基因轉染能夠增強細胞的增殖、遷移和血管生成能力，減少新內膜的形成，增加再內皮化，釋放高濃度的可溶性HGF蛋白。Ad-HGF能夠產生10倍于單純貼壁單核細胞的HGF，與單獨的細胞和基因治療相比，基于細胞的HGF基因治療是有效的治療方法，能夠減少細胞移植數(shù)量的要求，增強新生血管形成〔5〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，HGF基因治療可以促進低密度脂蛋白膽固醇經由P13GAkt信號通路對內皮細胞的損傷〔6〕。越來越多的證據(jù)表明，TGF-β1參與血管內皮細胞與周細胞的細胞間信號通訊，對血腦屏障的完整性具有重要作用。TGF-β1也是一多效能活性因子，參與調控細胞增殖、分化與凋亡，涉及胚胎發(fā)育及疾病發(fā)生等多種生物效應，其多效性因細胞不同而不同，并受細胞內主要活性因子影響。在周圍血管形成的研究中發(fā)現(xiàn)主要為TGF-β1/ALKs/Smads(Smad 2/3/4)信號通路參與信號調控〔7〕。TGF-β1與HGF的相互作用依不同細胞、不同細胞環(huán)境具有相互促進與相互抑制雙重效應，突出表現(xiàn)為HGF-TGF-β1平衡在組織損傷后的纖維化(膠質化)修復中具有明確的調控作用，HGF與TGF-β1相互平衡決定器官組織修復的結果〔8〕。 綜上所述，HGF基因轉染上清液相比較HGF能夠增強細胞的增殖、遷移和血管生成能力，可能與多種細胞活性因子參與相關的信號調控有關系。

4參考文獻

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7Nguyen HL，Lee YJ，Shin J，etal.TGF-β signaling in endothelial cells，but not neuroepithelial cells，is essential for cerebral vascular development〔J〕.Lab Invest，2011;91(11)：1554-63.

8Jeong SR，Kwon MJ，Lee HG，etal.Hepatocyte growth factor reduces astrocytic scar formation and promotes axonal growth beyond glial scars after spinal cord injury〔J〕.Exp Neurol，2012;233(1)：312-22.

〔2014-12-02修回〕

(編輯李相軍)