周秀錦， 張 靜， 邵宏宏， 周向陽， 鄭 斌， 周宇芳

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316000)

化學顯色法檢測磺胺類藥物的殘留量

周秀錦1， 張 靜1， 邵宏宏1， 周向陽1， 鄭 斌2， 周宇芳2

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 316000)

摘要[目的] 建立水產品中磺胺類藥物殘留的化學顯色快速檢測法。[方法] 用甲醇提取水產品中的磺胺類藥物殘留，采用化學顯色法對其進行快速檢測。[結果] 通過磺胺類藥物殘留與特定的衍生化試劑反應，形成穩(wěn)定的紫紅色衍生物，檢測靈敏度最低可達50 μg/kg。[結論] 該方法檢測限能滿足歐盟及我國對磺胺類藥物檢測的需求，且能夠實現(xiàn)水產樣品中多種磺胺類藥物的現(xiàn)場快速檢測。

關鍵詞磺胺類藥物；化學顯色；現(xiàn)場檢測；快速檢測

磺胺類藥物是以對氨基苯磺酰胺結構為主體的合成抗菌素的總稱，是一類用于預防和治療細菌感染性疾病的化學治療藥物[1-3]。近年來，隨著國內外對磺胺類藥物殘留的分析進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)了許多種檢測磺胺類藥物的方法，包括高效液相色譜法[4-7]、液相色譜-質譜法[8-9]、膠體金免疫層析法[10]、免疫分析法[11]和近紅外光譜法[12]等，但這些方法只注重于實驗室傳統(tǒng)檢測，且存在樣品前處理步驟復雜、耗費時間長、低通量、成本高等缺點。然而，水產品中藥物殘留的快速檢測技術十分匱乏，且前實驗室傳統(tǒng)的檢測方式很難實現(xiàn)快速、高效的檢測效果，越來越不適應食品的生產、流通和銷售特點。筆者圍繞水產品中有重大危害殘留的藥物磺胺類藥物，采用柱前衍生的方法，以化學顯色方法為主，水產品中的磺胺類藥物殘留使用合適的試劑進行快速提取和快速衍生化反應，選擇適合目標物的SPE柱凈化濃縮樣液，洗脫后采用合適方法進行快速準確地檢測和判斷。

1材料與方法

1.1試劑鹽酸、冰醋酸、硫酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、亞硝酸鈉、β-萘酚，均為分析純；乙腈和甲醇，色譜純；衍生化試劑01和衍生化試劑02；磺胺類藥物標準品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺甲基異惡唑；試驗用水為蒸餾水和去離子水；樣品為新鮮對蝦，購于舟山水產品批發(fā)市場。

1.2設備和器材液相色譜串聯(lián)質譜儀(API4000Q-TRAP)； 色譜柱為SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG S5(150 mm×2.0 mm)；恒溫水??；離心機；硅膠柱；HLB柱；氧化鋁柱；ENVI-18；層析柱(自填，3 ml)等。

1.3檢測條件

1.3.1色譜條件。色譜柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MG S5(150 mm×2.0 mm)流動相：A為0.1%的冰乙酸，B為甲醇；進樣量為10 μl。

1.3.2質譜條件。電噴霧離子源；正離子掃描；多反應監(jiān)測(MRM)；氣簾氣壓力(CUR)：10 psi；霧化氣壓力(GS1)：60 psi；輔助氣壓力(GS2)：60 psi；電噴霧電壓(IS)：5 500 v；離子源溫度(TEM)：500 ℃；碰撞氣壓力(CAD)：6.00 psi；EP電壓：7.00 v；碰撞室出口電壓(CXP)：15.0 V；去簇電壓(DP)和碰撞氣能量(CE)見表1。

表1　磺胺類藥物的部分參數(shù)

注：*表示定量離子。

1.4檢測方法

1.4.1磺胺類藥物標準物質的檢測。用甲醇將磺胺類藥物標準品溶解并稀釋到50和100 μg/L的濃度。分別取1 ml濃度為50和100 μg/L 磺胺類藥物標準溶液，加入4 ml的甲醇和2 ml衍生化試劑01，振搖5 min后加入0.1 ml衍生化試劑02，振蕩1 min，靜置5 min，觀察上層液體顏色；每5個重復，同時作試劑空白試驗。

1.4.2貝類樣品的前處理。準確稱取粉碎組織樣品5.0 g置于50 ml離心管中，取勻質的蝦肉5.0 g，加入5.0 g的無水硫酸鈉和甲醇20 ml，振蕩2 min后，靜置分層或4 000 r/min離心5 min，取約5 ml上清液于倒空的離心管瓶中，作為樣品處理液；在5 ml樣品處理液中加入2 ml衍生化試劑01，振蕩5 min后加入0.1 ml衍生化試劑02，振蕩1 min后靜置5 min，觀察上層液體顏色；若上層液體顯紅色則表明樣品中含有磺胺類藥物，并與標準品進行比較確定磺胺類藥物的含量，初步的檢測下限為100 μg/kg。

取層析柱一支依次加入2 ml甲醇和5 ml蒸餾水于層析柱中，控制流速為1～2滴/s，棄去流出液；衍生后的上層液體加入活化后的層析柱中，再加入2 ml去離子水淋洗柱子，抽干；最后，加入0.8 ml乙酸乙酯洗脫于5 ml離心管，觀察洗脫液顏色。

結果判斷：洗脫液邊自然揮發(fā)邊觀察顏色：若顯紅色，則表明樣品中含有磺胺類物質，其含量在50 μg/kg以上。

2結果與分析

2.1樣品前處理的最優(yōu)條件

2.1.1pH對衍生化效果的影響。取100 μg/kg磺胺類藥物標準溶液1 ml，加入4 ml的甲醇，再加入衍生化試劑01(調節(jié)pH分別為6、8、10、12)，進行衍生化反應，直接觀察不同pH下的衍生化效果，確定最佳的衍生化pH。結果表明，pH為6時無顏色變化；當pH≥8時，顏色有變化，且堿性越大，顏色越紅，因此當pH為12時衍生效果最為理想。

2.1.2層析柱的優(yōu)選。將樣品前處理中的衍生化上層液體，分別經自填層析柱、硅膠柱、HLB柱、氧化鋁柱、ENVI-18濃縮和凈化，根據每個SPE柱提供的處理方法，依次活化、平衡、上樣、淋洗和洗脫，觀察洗脫液的顏色變化。結果表明，層析柱、硅膠柱、HLB柱、氧化鋁柱、ENVI-18都有保留，但是自填層析柱的保留效率最好(圖1～2)。

2.2蝦肉樣品中磺胺類藥物殘留的檢測磺胺類藥物標準物質衍生物呈明顯的紫紅色，且顏色隨著含量的增加不斷加深，空白對照則不顯變色。當磺胺類藥物標準物質濃度在50 μg/L以上時，其衍生物在離心管內呈紫紅色。將該衍生物進行層析柱濃縮和凈化，在層析柱中的顏色更加明顯，洗脫后的顏色放置200 min后無明顯變化。

被檢蝦肉樣品中，加標樣品(添加磺胺嘧啶濃度為85 μg/kg)經過前處理，取1 ml的提取液直接上液相色譜串聯(lián)質譜儀，其質譜圖如圖3所示。另取5 ml提取液進行衍生化反應，其衍生化產物呈現(xiàn)紫紅色，陰性樣品無顯色(圖4)。

2.3穩(wěn)定特異性試驗結果磺胺類藥物添加量分別為50和100 μg/kg，平行測定12次。進行樣品前處理，提取液進衍生化反應，在衍生化后1.0、5.0、10、25、50、100、200 min分別觀察顯色現(xiàn)象。結果表明，衍生化產物在200 min內相對穩(wěn)定，紫紅顯色現(xiàn)象明顯。提取液的液相色譜串聯(lián)質譜圖如圖5所示，提取液的衍生化顯色圖如圖6所示。

2.4精密度試驗結果對60份已知含量的空白樣品進行磺胺類藥物標準添加驗證試驗，標準物質添加含量分別為50和100 μg/kg，由不同操作人員進行驗證試驗。當磺胺類藥物殘留添加濃度分別為50和100 μg/kg時，均可觀察到明顯的紫紅顯色，而陰性樣品無出現(xiàn)顏色變化。

2.5比對驗證試驗結果依據GB/T 21316-2007方法采樣液相色譜串聯(lián)質譜儀和中化學顯色法快速檢測325份水產品盲樣中的磺胺類藥物殘留，將二結果進行比對。液相色譜串聯(lián)質譜法檢測出含有磺胺類藥物殘留的樣品有62個，總含量范圍為2.0～103.5 μg/kg，總含量高于40 μg/kg的樣品有16個，其中40.0～50.0 μg/kg之間的樣品有2個?；瘜W顯色法快速檢測325份樣品，磺胺類藥物殘留含量在40.0～103.5 μg/kg的16個樣品均有不同程度的顯色反應，除40.0～50.0 μg/kg的2個樣品顯色較弱，需要細心辨認之外，二者結果符合。

3小結

貝類樣品采用甲醇提取，層析柱凈化富集，在堿性條件下進行衍生化反應，衍生化產物在200 min內保持相對穩(wěn)定，檢測在30 min內完成，實現(xiàn)了磺胺類藥物殘留的快速篩查，方法快速、準確、實用，可以有效篩選蝦肉中磺胺類藥物殘留。

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中圖分類號S851.34+7文獻標識碼A文章編號0517-6611(2015)30-109-03

基金項目國家科技支撐項目(2012BAD29B06)；舟山市科技項目(2012C23005)。

作者簡介周秀錦(1974- )，女，河南商水人，高級工程師，碩士，從事食品安全及標準化研究。

收稿日期2015-09-08

Determination of Sulfonamide Residues in Aquatic Products by Using Chemical Staining Method

ZHOU Xiu-jin, ZHANG jing, SHAO Hong-hong et al(Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan, Zhejiang 316000)

Abstract[Objective] The aim of this study was to develop a rapid chemical staining method of detecting the residues of sulfonamide in aquatic products. [Method] Sulfonamide residues in aquatic products were extracted with methanol and rapidly determined by using chemical staining method. [Result] Stable mauve derivatives were formed in the reaction of specific derivatization reagent and sulfonamide residues. The lowest detection sensitivity could reach 50 μg/kg. [Conclusion] The detection limit of this method could meet the detection requirements of sulfonamide residues in EU and China, and realize the on-site rapid detection of many kinds of sulfonamide residues in aquatic products samples.

Key wordsSulfonamides; Chemical staining method; On-site detection; Rapid detection