鄧燦新， 田東升， 李春燕， 趙揚(yáng)揚(yáng)， 曾仁權(quán)*， 曹 政*

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460；2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 402460)

羊棘球蚴(包蟲)間接ELISA抗體檢測試劑盒的研制

鄧燦新1， 田東升1， 李春燕2， 趙揚(yáng)揚(yáng)2， 曾仁權(quán)1*， 曹 政2*

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 402460；2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 402460)

摘要[目的]研制基于Eg95重組蛋白為檢測抗原的羊棘球蚴(包蟲)間接ELISA抗體檢測試劑盒。[方法]以細(xì)粒棘球蚴Eg95重組蛋白為檢測抗原，篩選間接ELISA的最佳反應(yīng)條件，確定ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)，檢測敏感性和重復(fù)性，組成、包裝試劑盒并初步應(yīng)用。[結(jié)果]建立的ELISA方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好，檢測陽性血清和陰性血清的準(zhǔn)確率均為100%。[結(jié)論]研制的羊棘球蚴(包蟲)病ELISA抗體檢測試劑盒可用于細(xì)粒棘球蚴Eg95亞單位疫苗抗體水平的檢測。

關(guān)鍵詞細(xì)粒棘球蚴；Eg95蛋白；試劑盒；ELISA

10002)。

我國是世界上棘球蚴病最嚴(yán)重的國家之一，我國西北地區(qū)(如甘肅、新疆、寧夏、內(nèi)蒙古、青海、四川、陜西、西藏等)，棘球蚴病尤為嚴(yán)重[1]。棘球蚴病是我國衛(wèi)生部規(guī)劃防治的五大寄生蟲病之一,現(xiàn)已證實(shí)全國有31個(gè)省(市、區(qū))存在包蟲病感染病例,有100多萬包蟲病現(xiàn)癥患者,受威脅人口達(dá)幾千萬,包蟲病畜超過4 000萬頭,每年新發(fā)病畜達(dá)800多萬頭,年經(jīng)濟(jì)損失超過10億元。該病已成為西部牧區(qū)群眾因病致貧、因病返貧的主要原因[2-3]。對動(dòng)物棘球蚴病的生前診斷比較困難，疫苗免疫已成為預(yù)防與控制棘球蚴病的重要途徑，但是國內(nèi)還沒有相應(yīng)的檢測試劑盒來評價(jià)疫苗的免疫效果，這就亟需準(zhǔn)確、有效的診斷方法的出現(xiàn)。為了建立簡單、有效的ELISA抗體檢測試劑盒，用于對疫苗的免疫效果進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測，為羊棘球蚴(包蟲)病基因工程亞單位苗提供了配套的檢測方法以評價(jià)疫苗的免疫效果，利用Eg95抗原的特異性和ELISA方法的快速、靈敏特點(diǎn)相結(jié)合研制出間接ELISA抗體檢測試劑盒，旨在為促進(jìn)細(xì)粒棘球蚴(包蟲)病基因工程亞單位苗的應(yīng)用及包蟲病的預(yù)防發(fā)揮重要作用。

1材料與方法

1.1重組Eg95蛋白和綿羊血清細(xì)粒棘球蚴Eg95重組蛋白，保存于-70 ℃冰箱中備用；綿羊血清均采自四川省邛崍市非疫區(qū)，保存于-20 ℃?zhèn)溆肹4]。

1.2主要試劑HRP酶穩(wěn)定劑和proclin300防腐劑均購自上海閃晶分子生物科技有限公司;包被緩沖液(pH9.6、0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液、TMB底物溶液、25×洗滌緩沖液(PBST)、樣品稀釋液、終止液、酶標(biāo)二抗、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和陽性血清。

1.3陰性血清和陽性血清的制備取未注射Eg95基因工程亞單位苗、未感染包蟲病的綿羊血清，經(jīng)Western blot方法鑒定為陰性，即為陰性血清。SDS-PAGE電泳加樣時(shí)，僅加入蛋白Mark與純化后Eg95重組蛋白，轉(zhuǎn)膜、分割后用于后續(xù)試驗(yàn)，第7步用1∶600倍稀釋的待檢血清作為一抗替代HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體溶液，37 ℃搖動(dòng)(70 r/min)孵育1 h后，用PBST漂洗3次，用封閉液1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG作為二抗，37 ℃搖動(dòng)(70 r/min)孵育1 h后，用PBST漂洗3次，加入TMB底物顯色。

用Eg95基因工程亞單位苗對綿羊進(jìn)行二次免疫，二免后1個(gè)月采血分離血凊，作為備選血清，選取60份備選血清和30份陰性血清用間接ELSA法測其OD450值。

1.4間接ELISA最佳反應(yīng)條件的篩選

1.4.1棋盤法確定抗原包被量及血清稀釋度。用包被緩沖液將純化到的重組Eg95蛋白分別作0.5、1、2、4 μg/ml 4個(gè)倍比稀釋度，包被酶標(biāo)板，37 ℃溫育1 h，然后4 ℃下過夜。用血清稀釋液將陽性血清及陰性血清分別進(jìn)行1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍比稀釋，組成方陣。其余條件不變，按照ELISA程序操作。結(jié)果判定以陽性血清OD450值(P)為1.000左右，陰性血清OD450值(N)低,且P/N值最大時(shí)的重組Eg95蛋白包被濃度和血清稀釋度為最佳條件。

1.4.2血清最佳作用時(shí)間的確定。在最適抗原濃度和血清稀釋度的基礎(chǔ)上，將血清作用時(shí)間分別設(shè)定為30、45、60 min，其他步驟按照ELISA程序操作，測定OD450值，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)比較分析數(shù)據(jù)，以確定血清作用的最佳時(shí)間[5-6]。

1.4.3酶標(biāo)二抗稀釋度及作用時(shí)間的確定。已確定的條件不變，將酶標(biāo)二抗進(jìn)行 1∶5 000、1∶10 000、1∶15 000稀釋(即將二抗保護(hù)劑稀釋后的二抗進(jìn)行1∶50、1∶100、1∶150稀釋)，分別于37 ℃條件下反應(yīng)30、45、60 min，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，測定OD450值，以確定酶標(biāo)二抗的稀釋度和作用的最佳時(shí)間。

1.4.4顯色時(shí)間的確定。已確定的條件不變，將底物于37 ℃條件下作用時(shí)間設(shè)定為5、10、15、20 min，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，終止反應(yīng)后，比較分析數(shù)據(jù)，以確定底物作用的最佳時(shí)間。

1.5ELISA判定標(biāo)準(zhǔn)的確定用 60份陰性綿羊血清為樣本按照已建立的方法進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，確定陰性和陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.6敏感性檢測用ELISA方法檢測1份陽性血清，從1∶200開始進(jìn)行一系列稀釋后作為一抗,確定能夠檢測出陽性的最高血清稀釋度。

1.7阻斷試驗(yàn)選取3份按1∶100稀釋陽性血清各100 μl，分別加入100 μl 10 μg/ ml重組Eg95蛋白，37 ℃下溫育1 h，然后8 000 r/min離心5 min，取100 μl上清作為一抗應(yīng)用該ELISA方法進(jìn)行檢測。同時(shí)，設(shè)置未阻斷的1∶200稀釋的陽性血清作為對照，比較2組血清的OD450值，觀察重組蛋白能否阻斷陽性血清反應(yīng)。

1.8重復(fù)性檢測

1.8.1批內(nèi)重復(fù)性檢測。取3份不同效價(jià)的綿羊陽性血清和3份綿羊陰性血清，每份血清作8個(gè)孔，用同一批包被的酶標(biāo)板在相同條件下同時(shí)進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.8.2批間重復(fù)性檢測。取3份不同效價(jià)綿羊陽性血清和1份綿羊陰性血清，每份綿羊血清作2個(gè)重復(fù)，用5個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板，在相同條件下同時(shí)進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

1.9ELISA方法的初步應(yīng)用隨機(jī)選取45份Eg95亞單位苗二免四周后綿羊血清用建立的ELISA方法進(jìn)行檢測；隨機(jī)選取 30份未免疫未患棘球蚴病綿羊血清30份進(jìn)行ELISA檢測。

1.10羊棘球蚴(包蟲)間接ELISA抗體檢測試劑盒的組成及包裝酶標(biāo)板室溫晾干后，用錫箔袋真空干燥(加干燥劑)包裝酶標(biāo)板，血清稀釋版為沒有包被抗原酶標(biāo)板。試劑盒的組成如表1所示，試劑盒示意圖見圖1。

表1　試劑盒的組成

1.11試劑盒的保存期試驗(yàn)將同一批次制備的試劑盒置于4 ℃下保存，每月各取1個(gè)試劑盒，按照試劑盒說明書作標(biāo)準(zhǔn)陰陽性對照，并對同一份陽性血清進(jìn)行敏感性測定，觀察其敏感性的變化，以確定試劑盒的保存期限。

2結(jié)果與分析

2.1間接ELISA最佳反應(yīng)條件的篩選結(jié)果

2.1.1Eg95重組蛋白的包被量和抗血清稀釋度的確定。由表2可知，包被抗原濃度為 2 μg/ml、血清1∶200 稀釋時(shí)，陽性血清OD450值在 1.000 左右，陰性血清OD450值較低，P/N值最高。因此，試驗(yàn)確定抗原的最佳包被濃度為 2 μg/ml，血清的最佳稀釋度為 1∶200。

2.1.2血清最佳作用時(shí)間的確定。由表3可知，當(dāng)血清作用時(shí)間為45 min時(shí)，陽性血清OD450(P)值在 1.000 左右，陰性血清OD450值(N)較低，且P/N值最大。因此，確定45 min為待測血清的最佳作用時(shí)間。

2.1.3酶標(biāo)二抗稀釋度及作用時(shí)間的確定。由表4可知，當(dāng)酶標(biāo)二抗以 1∶10 000 稀釋作用 30 min 時(shí)，陽性血清OD450值(P)在 1.000 左右,陰性血清OD450值(N)較低，且P/N值最大。因此，確定酶標(biāo)二抗以 1∶10 000 稀釋，作用時(shí)間為30 min。

表2　抗原最適包被濃度及血清最佳稀釋度的確定

表3　血清最佳作用時(shí)間的確定

表4　酶標(biāo)抗體工作濃度及作用時(shí)間的確定

2.1.4底物最佳顯色時(shí)間的確定。由表5可知，當(dāng)顯色時(shí)間為10 min時(shí)，P/N值最大，且陽性血清OD450值(P)也在1.000左右，陰性血清OD450值(N)較低。因此確定底物最佳顯色時(shí)間為10 min。

表5　底物顯色時(shí)間的確定

2.3敏感性檢測結(jié)果取1份綿羊陽性血清從1∶200倍開始倍比稀釋，進(jìn)行間接ELISA檢測。從圖3可以看出，當(dāng)血清稀釋度為1∶25 600時(shí)結(jié)果仍為陽性。這表明建立的方法具有較好的敏感性。

2.4阻斷試驗(yàn)結(jié)果用包被抗原蛋白和已知陽性血清進(jìn)行阻斷反應(yīng)，結(jié)果表明，經(jīng)重組Eg95蛋白處理過的3份陽性血清OD450值分別下降90.76%、90.53%和89.95%，表明該試驗(yàn)建立的間接ELISA方法具有良好的特異性。

2.5重復(fù)性檢測結(jié)果

2.5.1批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。針對建立的間接ELISA方法進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明6份綿羊血清測得OD450值的變異系數(shù)為2.24%～5.56%，均低于10%，表明該間接ELISA方法批內(nèi)重復(fù)性良好。

2.5.2批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。針對建立的間接ELISA方法進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果表明4份綿羊血清測得OD450值的變異系數(shù)為5.40%～8.67%，均小于 10%，表明該間接ELISA方法的批間重復(fù)性良好。

2.6ELISA方法的初步應(yīng)用結(jié)果用建立的ELISA方法對45份二免后綿羊血清和30份未免疫健康綿羊血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明二免后綿羊血清OD450值為0.595～1.608，均大于臨界值，判定為陽性；未免疫綿羊血清OD450值為0.060～0.147，均小于臨界值，判定為陰性。

2.7羊棘球蚴(包蟲)間接ELISA抗體檢測試劑盒的使用方法①取抗原包被板，分別將稀釋好的待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)對照各取100 μl加入到酶標(biāo)板孔中，陰性對照和陽性對照各設(shè)2孔，輕輕振勻孔中樣品(勿溢出)，置于37 ℃條件下溫育45 min；②取出96孔酶標(biāo)板，傾去孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干后每孔加入稀釋過的1×洗滌液 200 μl，輕輕振勻孔中液體(勿溢出)，每次洗板2 min，每次洗完在干凈吸水紙上拍干，共計(jì)洗板3次；③將兔抗綿羊酶標(biāo)二抗用稀釋液稀釋100倍，混勻，每孔加酶標(biāo)二抗100 μl，置于37 ℃條件下溫育30 min；④洗板，方法同上，但需洗4次；⑤將底物A、底物B按1∶1的比例混勻后,每孔加入100 μl，37 ℃條件下避光顯色10 min；⑥每孔加入終止液50 μl，10 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上測各孔OD450值;⑦結(jié)果判定：標(biāo)準(zhǔn)陽性血清血清OD450值≥0.6，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清OD450值≤0.159，ELISA試驗(yàn)成立，樣品OD450值≥0.196時(shí)，判為陽性；當(dāng)OD450值≤0.159時(shí)，判為陰性；若樣品OD450值介于二者之間則判為可疑，需重新檢測，若檢測結(jié)果仍小于 0.196則判定為陰性。

2.8試劑盒保存期的試驗(yàn)結(jié)果由表6可知，7次ELISA試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及標(biāo)準(zhǔn)陰性血清均成立，且保存6個(gè)月后檢測標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能檢出為陽性的最高稀釋度為1∶25 600，到第7個(gè)月標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能檢出為陽性的最高稀釋度下降到1∶12 800，說明試劑盒的檢測效果略有下降。這表明試劑盒在4 ℃條件下至少可以保存6個(gè)月。

表6　試劑盒保存期的測定結(jié)果

3討論

ELISA檢測試劑盒包被所用的抗原要求必須有優(yōu)質(zhì)和穩(wěn)定等特點(diǎn)，純度較高，抗原的純度直接關(guān)系到ELISA試驗(yàn)的特異性和敏感性?？乖坏臐舛纫矊υ囼?yàn)結(jié)果有著較大的影響。若抗原包被濃度過低，就會(huì)留下未吸附的抗原固相載體影響試驗(yàn)效果；若抗原包被濃度過高，就會(huì)使蛋白分子產(chǎn)生多層化現(xiàn)象，使蛋白容易被洗掉，從而出現(xiàn)非特異反應(yīng)及造成抗原的浪費(fèi)。通過對比0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml 4個(gè)包被濃度的試驗(yàn)結(jié)果，確定的最佳包被濃度為2 μg/ml。

若要得到準(zhǔn)確而且重復(fù)性好的試驗(yàn)結(jié)果，就要求血清樣品必須以一個(gè)最佳的稀釋度來進(jìn)行試驗(yàn)。經(jīng)過對比1∶50、1∶100、1∶200和1∶400 4個(gè)稀釋度和30、45、60 min 3個(gè)作用時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1∶200倍稀釋血清、作用45 min效果最佳。因此，試驗(yàn)選用1∶200來稀釋血清，37 ℃作用45 min。另外，待測血清的保存對ELISA試驗(yàn)也非常關(guān)鍵，若對血清的保存不當(dāng)將會(huì)導(dǎo)致假陽性和假陰性的結(jié)果出現(xiàn)，保存血清應(yīng)添加防腐劑，少量分裝后保存于-20 ℃條件下，避免反復(fù)凍融。

酶標(biāo)二抗也是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素。若酶標(biāo)二抗?jié)舛忍停蛔阋猿浞峙c血清中抗體結(jié)合；若酶標(biāo)二抗?jié)舛忍?，又?huì)造成非特異性吸附。經(jīng)過對比1∶5 000、1∶10 000和1∶15 000 3個(gè)稀釋度和30、45及60 min 3個(gè)作用時(shí)間的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)1∶10 000稀釋酶標(biāo)二抗及二抗37 ℃作用30 min效果最佳，因此試驗(yàn)選用1∶10 000來稀釋酶標(biāo)二抗，37 ℃下作用30 min。

敏感性、特異性與重復(fù)性是建立ELISA方法時(shí)必須要檢測的項(xiàng)目，是ELISA方法能否成功建立的關(guān)鍵。筆者將陽性血清稀釋25 600倍時(shí)，仍能檢測為陽性，說明建立的ELISA敏感性高。該試驗(yàn)用阻斷試驗(yàn)來反應(yīng)ELISA的特異性，所用Eg95蛋白對陽性血清的阻斷率在90%左右，說明Eg95蛋白能特異性阻斷陽性血清，表明該ELISA方法的特異性強(qiáng)；該試驗(yàn)的批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)表明變異系數(shù)均在2.24%～8.67%，均不超過10%，與張先鋒、吳洋、王芳等建立的ELISA方法的重復(fù)性相符，說明建立的ELISA方法的重復(fù)性良好[10]。試劑盒保存期的長短是影響試劑盒產(chǎn)業(yè)化的重要因素之一,也是試劑盒能否過關(guān)的關(guān)鍵因素。該試驗(yàn)建立的間接ELISA試劑盒在4 ℃條件下保存6個(gè)月后，敏感性無變化，表明試劑盒在4 ℃條件下可以保存6個(gè)月，與其他ELISA商品化試劑盒的保存期相近。

該ELISA方法對45份二免后綿羊血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陽性；對30份來自非疫區(qū)未免疫的健康綿羊血清進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性。這說明該ELISA方法可用于細(xì)粒棘球蚴Eg95亞單位疫苗抗體水平的檢測。但是，由于目前還沒有檢測細(xì)粒棘球蚴Eg95亞單位疫苗抗體的商品化試劑盒問世，所以筆者的建立ELISA方法還不能與其他ELISA檢測方法相比。

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中圖分類號S859.79+5文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611(2015)30-105-04

基金項(xiàng)目重慶市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(cstc2015jcsf-nycgzhA

作者簡介鄧燦新(1990- )，男，廣西梧州人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物病原生物學(xué)。 *通訊作者，曾仁權(quán)，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事動(dòng)物藥物化學(xué)研究。*通訊作者，曹政，研究員，博士，從事微生物分子生物學(xué)研究。

收稿日期2015-08-31

The Development of the Indirect ELISA Test Kit forEchinococcusgranulosusAntibody

DENG Can-xin1,TIAN Dong-sheng1,LI Chun-yan2,ZENG Ren-quan1*,CAO Zheng2*et al (1.Department of Veterinary Medicine,Southwest University,Chongqing 402460; 2.Chongqing Auleon Biological Company Limited,Chongqing 402460)

Abstract[Objective] This study was designed to develop an indirect ELISA kit for detecting antibodies against Echinococcus granulosus using recombinant EG95 protein as antigen.[Method] Eg95 recombinant protein as antigen,determined the optimal reaction conditions and criterion of indirect ELISA,detection sensitivity,repeatability,detected its sensitivity and repeatability.[Result] The ELISA method is high specificity,sensitivity,accuracy(100%) and good repeatability.[Conclusion] This ELISA kit could be used to monitor the immune status of the echinococcosis Eg95 genetic engineering subunit vaccine.

Key wordsEchinococcus granulosus; Eg95 protein; Kit; ELISA