蘇晨，趙愛(ài)華，張瑤楠，丁寧，郭永＊，王乾興

（1.遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，遵義 563000；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；3.解放軍第309醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100091）

全球乳腺癌發(fā)病率自20 世紀(jì)70 年代末開(kāi)始一直呈上升趨勢(shì)，作為嚴(yán)重威脅女性生命安全的主要疾病之一，乳腺癌的病因尚未完全清楚，醫(yī)生會(huì)根據(jù)腫瘤的分期和患者的身體狀況，酌情采用手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療、生物靶向治療及中醫(yī)藥輔助治療等多種手段，其中約2／3 的治療是激素治療［1］。米非司酮作為一種強(qiáng)抗孕激素類物，同時(shí)，米非司酮還具有增強(qiáng)抗癌藥物療效、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等其它一些新的功能，可用于乳腺癌的內(nèi)分泌治療［2］。米非司酮在孕激素受體陰性的乳腺癌中表現(xiàn)出抗癌作用，但其作用機(jī)制尚未明確，可見(jiàn)米非司酮的作用機(jī)制尤為復(fù)雜，米非司酮可以在不同條件下通過(guò)不同的作用機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。BRCA 腫瘤抑制基因（BRCA tumor suppressor）是乳腺癌／卵巢癌特異性的腫瘤抑制基因［3］。本研究旨在通過(guò)研究不同濃度米非司酮對(duì)乳腺癌細(xì)胞處理后中BRCA1、BRCA2蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步明確米非司酮的作用機(jī)制，為米非司酮乳腺癌內(nèi)分泌治療中相應(yīng)治療機(jī)制的闡明提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、材料與試劑

1.細(xì)胞系：乳腺癌細(xì)胞系MCF7購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.主要試劑：米非司酮（Sigma，美國(guó)），DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO，美 國(guó)），小 鼠 抗 人BRCA1 單 克 隆 抗 體（Calbiochem，德國(guó)），兔抗人BRCA2 多克隆抗體（Santa，美國(guó)），兩步法抗小鼠二抗檢測(cè)試劑盒、兩步法抗兔二抗檢測(cè)試劑盒、DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞處理方法及實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究［4］，分別用濃度為0.25、2.5、25和50μmol／L米非司酮處理人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 細(xì)胞，處理1d后分別收集不同處理組細(xì)胞。根據(jù)米非司酮的濃度分為：對(duì)照組（以空白溶劑代替米非司酮）、0.25μmol／L組、2.5μmol／L 組、25μmol／L 組 和50μmol／L組。

2.細(xì)胞爬片制備：將0.8cm×0.8cm 干凈玻璃片置于培養(yǎng)瓶底部，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于玻璃片后，取出玻璃片浸泡于丙酮︰甲醇（1︰1）固定液中，4℃固定15min，取出玻璃片，自然晾干，用中性樹膠貼附于載玻片上，進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞免疫組織化學(xué)法：將細(xì)胞爬片置PBS緩沖液中浸洗5min后，置于1% Triton X-100，室溫處理15min；PBS浸洗3次，5min／次，3% H2O2室溫孵育15 min；PBS 浸洗，分別滴加BRCA1 和BRCA2一抗稀釋液（抗BRCA1稀釋為1∶100，抗BRCA2為1∶150），4℃過(guò)夜。PBS浸洗，滴加兩步法二抗工作液，37℃孵育30min；PBS浸洗，DAB顯色劑顯色，顯微鏡下控制顯色情況；自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染15min；梯度酒精脫水透明，中性樹膠封片。PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

4.平均光密度值半定量分析：在顯微鏡下，分別隨機(jī)選取各組5 個(gè)視野拍照，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics，美國(guó)）對(duì)各組照片進(jìn)行平均光密度值半定量分析，樣本數(shù)值為5個(gè)視野光密度值的平均值。

5.BRCA1、BRCA2蛋白細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)率計(jì)算：由兩人分別對(duì)各組的5個(gè)視野進(jìn)行全細(xì)胞計(jì)數(shù)以及細(xì)胞核表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)率＝細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)，各組數(shù)值為各視野細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)率平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示，均數(shù)間多重比較采用Fisher LSD 檢驗(yàn)，多組間比較采用One-way ANONA，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、比較不同濃度米非司酮處理的MCF7細(xì)胞中BRCA1蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：對(duì)照組和米非司酮處理各組均呈BRCA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)（圖1）。與米非司酮處理各組相比較，對(duì)照組細(xì)胞中BRCA1蛋白表達(dá)較弱，且呈細(xì)胞胞漿陽(yáng)性（圖1A）；米非司酮0.25μmol／L組細(xì)胞BRCA1蛋白主要表達(dá)于胞漿，少量細(xì)胞呈核陽(yáng)性（圖1B）；米非司酮2.5μmol／L組細(xì)胞BRCA1蛋白陽(yáng)性強(qiáng)于其他各組，其細(xì)胞核和細(xì)胞漿均為陽(yáng)性（圖1C）；陰性對(duì)照組未有陽(yáng)性表達(dá)（圖1F）。

采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics）進(jìn)行各組圖像平均光密度值分析，結(jié)果顯示：與其他各組相比較，2.5μmol／L 組BRCA1蛋白表達(dá)量最高，顯著高于其他各組（P 均＜0.05）；25μmol／L 組BRCA1 蛋 白 表 達(dá) 量 高 于 對(duì) 照 組、0.25μmol／L組和50μmol／L 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）；對(duì) 照 組、0.25 μmol／L 組 和50μmol／L組各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）（圖2）。

二、比較不同米非司酮處理的MCF7 細(xì)胞中BRCA2蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示：BRCA2蛋白在對(duì)照組和米非司酮處理各組均有表達(dá)（圖3）。對(duì)照組細(xì)胞中，BRCA2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中（圖3A）；米非司酮各組BRCA2蛋白陽(yáng)性較強(qiáng)，細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)（圖3B、C、D 和E）陰性對(duì)照組未有陽(yáng)性表達(dá)（圖3F）。

各組圖像平均光密度值比較發(fā)現(xiàn)：米非司酮處理各組平均光密度值均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）；2.5μmol／L 組平均光密度值最高，顯著高于0.25μmol／L 組、25μmol／L 組和50μmol／L組（P＜0.05）（圖4）。

三、不同濃度米非司酮組細(xì)胞核BRCA1、BRCA2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率

對(duì)照組細(xì)胞核中BRCA1和BRCA2 蛋白陽(yáng)性表 達(dá) 率［（分 別 為（19.58±6.90）% 和（36.60±3.01）%）］均較低，顯著低于米非司酮其他各組（P 均＜0.05）；2.5μmol／L組和25μmol／L組細(xì)胞核中BRCA1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于0.25μmol／L組和50μmol／L 組，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（P 均＜0.05）；米非司酮處理各組細(xì)胞核BRCA2蛋白陽(yáng)性率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

乳腺癌易感基因1（BRCA1）和乳腺癌易感基因2（BRCA2）是乳腺癌發(fā)生有關(guān)的兩個(gè)易感基因，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與這兩種基因的異常表達(dá)密切相關(guān)。BRCA1 是1990 年首次發(fā)現(xiàn)并定位于17號(hào)染色體的長(zhǎng)臂的多功能區(qū)核蛋白，基因結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)約81KB，包含24個(gè)外顯 子，其中22個(gè)編碼［5］；BRCA2是1994 年由Wooster等［6］定位于13q12-13，基因結(jié)構(gòu)全長(zhǎng)約60kb，由10 254 個(gè)核苷酸組成，含21 個(gè)外顯子。抑癌基因BRCA 表達(dá)的蛋白具有重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和泛素化等，尤以兩者在DNA 損傷修復(fù)、同源重組和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的功能最為顯著和重要。

圖1 不同濃度米非司酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的BRCA1蛋白的表達(dá)影響。免疫組化法×200

圖2 不同濃度米非司酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的BRCA1蛋白表達(dá)定量分析結(jié)果

目前臨床上已經(jīng)將米非司酮廣泛用于抗腫瘤的治療，也已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。目前關(guān)于米非司酮抗腫瘤作用的可能機(jī)制主要有：促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［7］、抑制腫瘤細(xì) 胞的增殖［8］、調(diào)節(jié)細(xì)胞 周期［9］、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子或受體［10］、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性［11］等。1987年，Bardon等［12］發(fā)現(xiàn)米非司酮具有抗乳腺癌細(xì)胞增殖作用。業(yè)已證實(shí)，米非司酮對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞有劑量依賴性的生長(zhǎng)抑制作用，而且這種作用與細(xì)胞中孕酮受體呈明顯正相關(guān)，作用機(jī)制可能與其各自的孕酮受體容量有關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于絕經(jīng)前婦女，米非司酮（連續(xù)3個(gè)月隔天給予50mg劑量）能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，對(duì)于乳腺上皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用［13］。

3 不同濃度米非司酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的BRCA2蛋白表達(dá)影響。免疫組化法×200

圖4 不同濃度米非司酮對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞的BRCA2蛋白表達(dá)定量分析結(jié)果

表1 不同濃度米非司酮組細(xì)胞核BRCA1、BRCA2蛋白陽(yáng)性率比較［（±s）%］

表1 不同濃度米非司酮組細(xì)胞核BRCA1、BRCA2蛋白陽(yáng)性率比較［（±s）%］

注：與米非司酮各組比較，＊P 均＜0.05；分別與50 μmol／L組比較，＃P＜0.05

組 別 BRCA1蛋白陽(yáng)性率 BRCA2蛋白陽(yáng)性率對(duì)照組 19.58±6.90＊ 36.60±3.01＊0.25μmol／L 50.32±8.83 93.65±2.45 2.5μmol／L 95.92±0.27＃ 95.79±0.86 25μmol／L 93.26±3.37＃ 97.40±0.97 50μmol／L 63.49±34.14 85.69±23.61

我們前期結(jié)果顯示，米非司酮抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和T47D 細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2006年，Poole等［14］在Science雜志上發(fā)表了他們研究小組的重要結(jié)果：BRCA1／p53 基因敲除小鼠中米非司酮可以抑制乳腺癌的生長(zhǎng)。有研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，BRCA1基因的表達(dá)受激素的調(diào)控（雌激素和孕激素）［15］，而米非司酮作為孕激素受體的拮抗劑極有可能通過(guò)調(diào)控BRCA1或BRCA2在乳腺癌中發(fā)揮作用。我們前期研究證實(shí)，米非司酮確實(shí)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控BRCA1 和BRCA2 基因的表達(dá)［16］。而本研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮也在蛋白水平上上調(diào)乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞中BRCA1、BRCA2的表達(dá)。與對(duì)照組比較，不同濃度米非司酮處理后，MCF7細(xì)胞中BRCA1 和BRCA2蛋白的表達(dá)量均增加，2.5μmol／L 組BRCA1和BRCA2蛋白表達(dá)量最高，但隨著米非司酮濃度增加，BRCA1 和BRCA2蛋白的表達(dá)量有所降低，可能是不同濃度米非司酮促蛋白表達(dá)模式不同。

BRCA1和BRCA2 腫瘤抑制基因的主要功能是參與細(xì)胞分裂S 期和細(xì)胞DNA 損傷后的DNA修復(fù)，BRCA 突變細(xì)胞缺乏染色體雙鏈DNA 缺口的修復(fù)能力，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定。在突變攜帶人群中，由于不能有效地進(jìn)行DNA 雙鏈缺口修復(fù)，從而導(dǎo)致早期乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生［17］。本研究顯示，米非司酮處理后，BRCA1和BRCA2蛋白表達(dá)有空間定位變化，對(duì)照組細(xì)胞中BRCA1蛋白呈細(xì)胞胞漿陽(yáng)性；米非司酮0.25μmol／L 組則主要表達(dá)于胞漿，少量細(xì)胞呈核陽(yáng)性；米非司酮2.5μmol／L 組細(xì)胞核和細(xì)胞漿均為陽(yáng)性。對(duì)照組細(xì)胞中，BRCA2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中；米非司酮各組細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)。通過(guò)比較各組的細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)率發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞核中BRCA1和BRCA2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為（19.58±6.90）%和（36.60±3.01）%，均呈較低狀態(tài)，且顯著低于米非司酮各個(gè)組（P 均＜0.05）；米非司酮2.5μmol／L組和25μmol／L組細(xì)胞核中BRCA1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于0.25μmol／L組和50μmol／L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。即米非司酮可以促進(jìn)MCF7細(xì)胞中BRCA1、BRCA2蛋白的入核表達(dá)，有利于BRCA1和BRCA2基因發(fā)揮DNA修復(fù)、同源重組和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能，但米非司酮調(diào)控的具體作用機(jī)制及其生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步深入展開(kāi)研究。

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