徐進，張翠蓮，李航生，張靜，常瓊，張耀，張合龍

（河南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，鄭州 450003）

早在幾十年前人們就認識到免疫因素對不孕的影響［1］。自此以后人們開始研究免疫系統(tǒng)對生殖系統(tǒng)各個方面的影響，臨床上把由免疫因素引起的不孕癥稱為免疫性不孕［2］。研究發(fā)現，習慣性流產及多次體外受精-胚胎移植（IVF-ET）失敗的患者，多存在外周血淋巴細胞比例異常［3-6］。T 細胞是重要的淋巴細胞，介導細胞免疫應答，主要行使CD4＋T細胞的遲發(fā)型超敏反應（DTH）和CD8＋T 細胞的毒性殺傷（CTL）作用。血液中的T 淋巴細胞比例失調往往預示著妊娠失敗或者流產［3-6］。

濾泡液為卵母細胞提供生存的微環(huán)境，濾泡液中富含卵母細胞發(fā)育成熟所必須的激素、蛋白、糖類、活性氧、抗凋亡因子、細胞因子、生長因子等化學物質［7］，濾泡液中還含有豐富的淋巴細胞，這些物質的紊亂或比例失調直接影響到卵母細胞的質量、獲卵率及受精率甚至患者的妊娠結局。

本實驗通過測定ICSI助孕治療患者取卵日濾泡液中T、B 淋巴細胞比例，以探討濾泡液中T、B淋巴細胞對卵母細胞及胚胎的可能影響。

材料與方法

一、材料

1.患者選擇及處理：選自首次接受ICSI助孕治療的患者。

納入標準：年齡＜35歲，身體健康，無免疫性疾病史，平素月經規(guī)律，基礎內分泌水平正常，不育因素為單純男方嚴重少弱精子癥或梗阻性無精子癥。

患者于黃體中期開始給予達必佳（輝凌，德國）0.1mg，ih，qd，連續(xù)用藥18d后改為0.05mg，ih，qd，同時加用促排卵藥（果納芬，默克雪蘭諾，德國，或普麗康，默沙東，荷蘭）150～225U，ih，qd。當有60%的卵泡平均直徑超過18mm 時，給予HCG（珠海麗珠）7 000～10 000U 肌肉注射，36.5～37h手術取卵。

2.濾泡液收集及分組：手術日經陰道超聲引導下濾泡液抽吸取卵，收集取卵后清亮濾泡液待測。根據獲卵情況分為兩組：獲卵率（獲卵數／穿刺卵泡數）＞80%為A 組（20例），獲卵率＜50%為B組（20例）。

3.主要儀器：流式細胞儀（NAVIOS）（Becton-Dickinson，美國）、臺式離心機、渦旋震蕩器、微量移液器（1 000μl、100μl、10μl）、流式細胞專用試管。

4.檢測試劑：Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG1-PE、Mouse IgG1-APC、CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC、CD19-APC，PBS，BD FACS Lysing Solution紅細胞裂解液（10×）（Becton-Dickinson，美國）。

二、方法

1.實驗步驟：取7支流式試管，分別標記①對照管、②FITC、③PE、④PerCP、⑤APC、⑥3-8-4-45、⑦3-16／56-19-45。對照管分別加入20μl Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG1-PE、Mouse IgG1-APC、CD45-PerCP熒光抗體；②～⑤管依次加入20μl CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC 熒 光 抗體；⑥管分別加入20μl CD3-FITC、CD8-PE、CD45-PerCP、CD4-APC熒光抗體；⑦管分別加入20μl CD3-FITC、CD45-PerCP、CD19-APC熒光抗體。

分別取100μl處理后的濾泡液細胞懸液加入每支試管中。依次用1×FACS Lysing Solution及PBS處理后，4℃避光1h內上機檢測。標本用NAVIOS 流式細胞儀獲取數據。每個樣本收集10 000個細胞。

2.軟件分析：用Kaluza軟件進行結果分析，在CD45／SSC散點圖設門（R1）為淋巴細胞，其余散點圖顯示均為R1 門細胞，以①管為標尺，分別得出CD3和CD4 雙 陽 細 胞、CD3 和CD8 雙 陽 細 胞、CD19陽性細胞。

三、統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，對相關數據進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用t檢驗，計數資料（%）采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兩組患者基本特征

兩組患者的平均年齡、不育年限、基礎卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）水平、平均用藥天數、平均用藥量相比較，均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表1）。

表1 兩組患者基本情況比較（±s）

表1 兩組患者基本情況比較（±s）

組 別 例數 平均年齡（歲）不育年限（年） FSH（U／L） LH（U／L） E2（pmol／L） P（nmol／L） 用藥天數（d） 用藥量（U）A組 20 29.7±3.2 3.2±2.5 7.5±2.3 5.7±4.1 92.9±35.2 2.2±1.0 11±2.4 2 280±357 B組 20 28.5±4.3 3.7±2.1 6.8±2.9 5.2±3.8 104.2±37.4 1.6±1.3 12±3.1 2 132±348

二、兩組獲卵及胚胎形成情況比較

A 組的平均獲卵數、MⅡ卵數、受精卵數及可利用胚胎數均顯著高于B組（P＜0.05）；兩組間獲卵率（獲卵數／穿刺卵泡數）比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但受精率（受精卵數／成熟卵數）及可利用胚胎率（可利用胚胎數／受精卵數）均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表2）。

三、兩組濾泡液中淋巴細胞亞群的比較

兩組間CD4＋T 淋巴細胞及B淋巴細胞均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；A 組CD8＋T 淋巴細胞顯著低于B組（P＜0.05）（表3，圖1）。

表2 兩組獲卵及胚胎形成情況結果比較［（±s），%］

表2 兩組獲卵及胚胎形成情況結果比較［（±s），%］

注：與A 組比較，＊P＜0.05

組別 例數 穿刺卵泡數（個）獲卵數（枚）MⅡ卵數（枚） 獲卵率 受精卵數（枚） 受精率 可利用胚胎數（枚）可利用胚胎率A 組 20 14.1±4.2 12.8±4.3 9.3±6.2 90.8 7.7±3.4 82.8 5.2±3.4 67.5 B組 20 13.5±3.1 6.6±3.7＊ 5.1±2.7＊ 48.9＊ 4.2±2.6＊ 82.4 2.8±1.6＊66.7

表3 兩組濾泡液中淋巴細胞亞群的比較（%）

圖1 濾泡液中淋巴細胞亞群流式細胞分析

討 論

濾泡液作為卵母細胞生存的微環(huán)境，含有豐富的卵母細胞發(fā)育成熟所必需的化學物質，包括激素、蛋白、活性氧、細胞因子、生長因子等。濾泡液微環(huán)境的改變直接影響到母體的生育能力，代謝紊亂和能量失衡可以引起卵巢功能的紊亂，影響到生長發(fā)育中卵母細胞的質量［8］。濾泡液中的皮質醇可能對卵丘細胞脂質分解起一定作用，其含量與卵丘細胞脂質含量成負相關［9］。研究表明濾泡液中過氧化物含量和抗氧化狀態(tài)影響不育患者的妊娠結局。卵巢的氧化應激反應明顯高于血漿的氧化應激反應，升高的氧化應激水平有利于促排卵過程中獲得較多的成熟卵［10］。卵巢儲備功能降低或高齡患者能夠改變卵泡細胞、濾泡液的代謝物質，這些改變能夠影響卵母細胞的發(fā)育潛能及胚胎的發(fā)育潛能［11］。濾泡液中還含有淋巴細胞，特發(fā)性不育患者的濾泡液中細胞毒性CD16＋、CD56-、NK 細胞亞群數量增加，并且這種增加能夠降低受精率［12］。

T 細胞作為免疫效應細胞，主要行使CD4＋T細胞的DTH 和CD8＋T 細胞的CTL 作用。CD8＋細胞毒性T 細胞在細胞免疫、抗病毒感染、抗腫瘤及器官移植排斥中發(fā)揮重要作用。其主要作用是直接特異性殺傷帶有MHC-Ⅰ類分子的靶細胞。成熟B細胞可在識別抗原后進一步分化為能分泌特異性免疫球蛋白的漿細胞和攜帶抗原信息的記憶性B細胞。B細胞能產生抗體發(fā)揮抗體的中和作用、調理作用及抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用。另外活化的B 細胞可產生多種細胞因子，參與免疫調節(jié)、炎癥反應和造血過程。

在月經各期和早孕的子宮內膜中T 細胞數量相對穩(wěn)定，和外周血中T 細胞不同，子宮內膜間質中超過2／3 的T 細胞為CD8＋T 細胞（外周血中CD4＋T 細胞占65%，CD8＋占35%）。在圍著床期，子宮內膜局部分泌一些化學因子，能使T 細胞（主要是Th2細胞）遷移進入子宮，使胚胎成功著床［13］。通過比較妊娠過程中外周血和蛻膜中T 細胞情況，發(fā)現子宮蛻膜主要為Th2和Tc2，其數量遠遠大于外周血。所以，子宮內膜或蛻膜的Th2和Tc2細胞可能通過其產生的細胞因子來調節(jié)圍著床期子宮內膜對胚胎的適應性反應，有利于胚胎的成功種植和妊娠的維持［14-15］。T 細胞在卵巢功能早衰中起著至關重要的作用，其中Th1細胞占優(yōu)勢。Th1細胞分泌白介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等誘導顆粒細胞及黃體細胞MHC-Ⅱ類抗原的表達，誘發(fā)自身免疫應答，使顆粒細胞和卵泡受到破壞，從而發(fā)生卵巢功能早衰。這類患者外周血CD8＋T 細胞明顯升高，CD4＋／CD8＋T 細胞的比值下降，與血清E2水平下降相關。卵巢功能早衰患者的卵巢內還能檢測到細胞毒性殺傷細胞。T 細胞在濾泡液中的研究表明，濾泡液中T 細胞數量的變化并不能預示妊娠的結局［16］。CD27是記憶性B細胞的表面抗原。不孕患者及有不良孕史的患者外周血CD27＋B 細胞明顯低于正常懷孕組。外周血CD27＋B 細胞的表達降低或不正常表達，均提示免疫功能的紊亂［17-20］。但不孕患者外周血總的B 細胞數與正常患者相比并沒有顯著性增加。不孕患者和多次IVF 助孕失敗的患者濾泡液中CD27＋B 細胞明顯高于流產組和宮外孕組［21］。無論是不孕患者還是助孕后成功受孕的患者卵泡液中B 細胞的百分率都小于外周血濃度［21］。

我們的研究顯示，濾泡液中T 淋巴細胞亞群的變化并不影響患者的受精率及可利用胚胎率，但卻影響獲卵率。兩組患者濾泡液中成熟B 淋巴細胞數并沒有顯著不同，提示B 淋巴細胞參與的體液免疫調節(jié)在濾泡液中的影響可能很小。免疫系統(tǒng)中免疫細胞之間相互影響，所分泌的細胞因子之間存在網格狀交互作用。免疫細胞對卵母細胞及獲卵率的影響也絕不是單一的作用，其具體機制還需進一步深入研究。

［1］ Medawarp B.Some immunological and endocrinological problems raised by the evolution of viviparity in vertebrates［J］.Symp Soc Exp Biol，1953，7：320-338.

［2］ Kaider AS，Kaider BD，Janowic PB，et al.Immunodiagnostic evaluation of women with reproductive failure［J］.Am J Reprod Immunol，1999，42：335-346.

［3］ Gleicher N，Liu HC，Dudkiewitcz A，et al.Autoantibody profiles and immunoglobulin levels a predictors of in vitro fertilization［J］.Am J Obstet Gynecol，1994，170：1145-1149.

［4］ Ng SC，Gilman-Sachs A，Thaker P，et al.Expression of intracellular Th1and Th2cytokines in women with recurrent spontaneous abortion，implantation failures after IVF／ET or normal pregnancy［J］.Am J Reprod Immunol，2002，48：77-86.

［5］ Nip MM，Taylor PV，Rutheford AJ，et al.Autoantibodies and antisperm antibodies in sera and follicular fluids of infertile patients；relation to reproductive outcome after in-vitro fertilization［J］.Hum Reprod，1995，10：2564-2569.

［6］ Kwak-Kim JY，Chung-Bang HS，Ng SC，et al.Increased T helper 1cytokine responses by circulating T cells are present in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with multiple implantation failures after IVF［J］.Hum Reprod，2003，18：767-773.

［7］ Revelli A，Delle Piane L，Casano S，et al.Follicular fluid content and oocyte quality：from single biochemical markers to metabolomics［J］.Reprod Biol Endocrinol，2009，7：40.

［8］ Leroy JL，Rizos D，Sturmey R，et al.Intrafollicular conditions as a major link between maternal metabolism and oocyte quality：a focus on dairy cow fertility［J］.Reprod Fertil，2011，24：1-12.

［9］ Simerman AA，Hill DL，Grogan TR，et al.Intrafollicular cortisol levels inversely correlate with cumulus cell lipid content as a possible energy source during oocyte meiotic resumption in women undergoing ovarian stimulation for in vitro fertilization［J］.Fertil Steril，2015，103：249-257.

［10］ Velthut A，Zilmer M，Zilmer K，et al.Elevated blood plasma antioxidant status is favourable for achieving IVF／ICSI pregnancy［J／OL］ .Reprod Biomed Online，2013，26：345-352.

［11］ Pacella L，Zander-Fox DL，Armstrong DT，et al.Women with reduced ovarian reserve or advanced maternal age have an altered follicular environment［J］.Fertil Steril，2012，98：986-994.

［12］ Wold AS，Arici A.Natural killer cells and reproductive failure［J］.Curr Opin Obstet Gynecol，2005，17：237-241.

［13］ Ingman WV，Jones RL.Cytokine knockouts in reproduction：the use of gene ablation to dissect roles of cytokines in reproductive biology［J］.Hum Reprod Update，2008，14：179-192.

［14］ Kalu E，Bhaskaran S，Thum MY，et al.Serial estimation of Th1：Th2 cytokines profile in women undergoing in vitro fertilization-embryo transfer［J］.Am J Reprod Immunol，2008，59：206-211.

［15］ Saito S，Nakashima A，Shima T，et al.Th1／Th2／Th17and regulatory T-cell paradigm in pregnancy［J］.Am J Reprod Immunol，2010，63：601-610.

［16］ Gaafar TM，Hanna MO，Hammady MR，et al.Evaluation of cytokines in follicular fluid and their effect on fertilization and pregnancy outcome［J］.Immunol Invest，2014，43：572-584.

［17］ Agematsu K，Futatani T，Hokibara S.Absence of memory B cells in patients with common variable immunodeficiency［J］.Clin Immunol，2002，103：34-42.

［18］ Warnatz K，Denz A，Dr?ger R，et al.Severe deficiency of switched memory B cells（CD27（＋）IgM （-）IgD（-））in subgroups of patients with common variable immunodeficiency：a new approach to classify a heterogenous disease［J］.Blood，2002，99：1544-1551.

［19］ Bohnhorst JO，Thoen JE，Natvig JB，et al.Significantly depressed percentage of CD27＋（memory）B cells among peripheral blood B cells in patients with primary Sj?gren’s syndrome［J］.Scand J Immunol，2001，54：421-427.

［20］ Bohnhorst JO，Bjorgan MB，Thoen JE.Abnormal B cell differentiation in primary sjogren’s syndrome results in a depressed percentage of circulating memory B cells and elevated levels of soluble CD27that correlate with serum IgG concentrations［J］.Clin Immunol，2002，103：79-88.

［21］ Vujisic S，Zidovec Lepej S，Aksamija A，et al.B-and T-cells in the follicular fiuid and peripheral blood of patients undergoing IVF／ET procedures［J］.AJRI，2004，52：379-385.