韓志勇，屈波，張東旭，張利軍，李玲

(蘭州理工大學(xué) 石油化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730050)

石油在其開采、運輸、加工和使用過程中產(chǎn)生的污染物會對生態(tài)環(huán)境和人類健康存在潛在的威脅［1］，其主要污染物有n-烷烴(TNA)、放射性物質(zhì)、苯、酚類化合物、腐殖酸和多環(huán)芳烴(PAHs)［2-3］。核桃殼具有堅韌性大、耐磨抗壓、吸附能力強(qiáng)、抗油浸、不含有毒物質(zhì)、在酸、堿和水中溶解度很小、進(jìn)入水體不會引起水質(zhì)惡化等優(yōu)點［4-5］，是油田、冶煉、環(huán)?；さ刃袠I(yè)含油污水處理的理想材料。

固定化生物技術(shù)是采用物理或化學(xué)手段將游離細(xì)胞或酶限定于一定空間內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用的一種方法［6］，已成功應(yīng)用在水、大氣和土壤污染防治領(lǐng)域，尤其對生物難降解有機(jī)物［7-9］、高濃度有機(jī)廢水［10-11］和大氣中H2S、NOX和SOX［12-14］均有較好的處理效果。

本研究選用核桃殼作為生物載體，探索固定化微生物降解原油的最佳條件，以期為固定化微生物技術(shù)處理石油烴類污染物提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

蛋白胨、酵母粉、NaCl、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·7H2O、Fe2(SO4)3、MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、CaCl2均為分析純;耐低溫石油降解菌JA 和JB(從長慶油田長期受石油污染土壤中篩選和馴化);核桃殼(粉碎至12 ～22 目)。

SKY-200B 恒溫培養(yǎng)振蕩器;SW-CJ-2F 型生物潔凈工作臺;DNP-9082 恒溫培養(yǎng)箱;PHS.3C 精密pH 計;AB204-L 型分析天平;UV-2010PC 紫外可見分光光度計;YXQGOZ 型電熱式蒸汽消毒器。

1.2 培養(yǎng)基配制

1.2.1 原油培養(yǎng)基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，原油1 mL，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH 值為7.5。

1.2.2 無機(jī)鹽培養(yǎng)基 NH4Cl 0.511 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0. 03 g，F(xiàn)e2(SO4)30. 03 g，MnSO4·H2O 0. 04 g，ZnSO4·H2O 0. 05 g，CaCl20.01 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH 值為7.5。

1.2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH 值為7.5。配制固體培養(yǎng)基需加入18 ～20 g 瓊脂。

1.3 固定化混合菌的制備

稱取一定量的核桃殼，放入錐形瓶，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后，加入50 mL 活化17 h的混合菌液，于180 r/min 搖床中15 ℃恒溫固定24 h。過濾，用無菌生理鹽水清洗3 次，即得到固定化混合菌。

1.4 實驗方法［6，16］

在50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2.0 g JA 和JB復(fù)配比1 ∶2 的固定化菌，pH 7. 5，原油質(zhì)量濃度5 g/L 條件下，于180 r/min 搖床中15 ℃恒溫降解5 d。采用超聲-索氏萃取-重量法［17］測定原油降解率。

式中 R——原油降解率，%;

m1——無機(jī)鹽培養(yǎng)基中原油質(zhì)量g;

m2——5 d 后原油質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合菌復(fù)配比

在50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2.0 g 固定化菌，在pH 值為7.5、溫度15 ℃、原油質(zhì)量濃度5 g/L條件下，考察JA 和JB 復(fù)配比例對R 的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 固定化菌復(fù)配比對原油降解效果的影響Fig.1 Effect of immobilized bacteria complex ratio on crude oil degradation result

由圖1 可知，對原油的降解能力復(fù)配菌均高于單菌，JA 和JB 的生物量以1∶2 復(fù)配后，原油降解率達(dá)到63.92%，均高于1∶1 和2∶1 配比時的原油降解率。這是由于菌株按比例復(fù)配后，有利于發(fā)揮菌株互助作用，從而提高原油降解率［18］，因此選擇菌株復(fù)配比例為1∶2 進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 原油質(zhì)量濃度的影響

在50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2.0 g JA∶JB=1∶2的固定化復(fù)配菌，在pH=7.5、溫度15 ℃的條件下，研究原油質(zhì)量濃度對原油降解率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 原油質(zhì)量濃度對原油降解率的影響Fig.2 Effect of crude oil initial mass concentration on the degradation rate of crude oil

由圖2 可知，當(dāng)原油質(zhì)量濃度＜4 g/L 時，原油降解率隨著原油濃度的增加而直線上升;當(dāng)原油濃度＞4 g/L 時，原油降解率降低。這是由于原油濃度不高時，培養(yǎng)液中底物濃度的增加可以促進(jìn)菌株生長，從而提高了原油降解率。原油濃度過高，會降低原油在溶液中的分子擴(kuò)散性能，并抑制菌株的生長繁殖，從而對原油的降解效果下降。選擇原油質(zhì)量濃度為4 g/L 進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 pH 值的影響

在50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入2.0 g JA∶JB=1∶2 固定化復(fù)配菌，在原油質(zhì)量濃度4 g/L、溫度15 ℃的條件下，考察pH 值對原油降解率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 pH 對原油降解率的影響Fig.3 Effect of pH value on the degradation rate of crude oil

由圖3 可知，當(dāng)pH ＜7.5 時，原油降解率隨著pH 的上升而增加;當(dāng)pH ＞7.5 時，原油降解率隨著pH 的上升而降低。這是由于pH 過高或過低，均會影響細(xì)胞酶的穩(wěn)定性和細(xì)胞酶活性中心重要基團(tuán)的解離狀態(tài)及原油基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而降低細(xì)胞代謝能力［18］。在pH 7.5 時細(xì)胞酶表現(xiàn)出最高的催化活性，促進(jìn)細(xì)胞對原油的代謝，使原油降解率達(dá)到最高。

2.4 固定化混合菌投加量的影響

在50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入固定化復(fù)配菌，在原油質(zhì)量濃度4 g/L、pH=7.5、溫度15 ℃的條件下，考察固定化混合菌投加量對原油降解率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 固定化混合菌投加量對原油降解率的影響Fig.4 Effect of immobilized mixed bacteria dosage on the degradation rate of crude oil

由圖4 可知，當(dāng)固定化混合菌投加量＜30 g/L時，隨著固定化混合菌投加量的增大，原油降解率升高;固定化混合菌投加量＞30 g/L 時，原油降解率下降。當(dāng)固定化混合菌投加量低時，固定化微生物量較少，培養(yǎng)基為微生物提供了充足的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)微生物的生長繁殖;隨著固定化混合菌投加量的不斷增大，固定化微生物量也逐漸增加，微生物之間為爭奪營養(yǎng)物質(zhì)而產(chǎn)生競爭和抑制關(guān)系，使原油降解率下降。

2.5 固定化時間的影響

在50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2 g 固定化微生物，在原油質(zhì)量濃度4 g/L、pH 值為7.5、溫度15 ℃的條件下，考察微生物固定化時間對原油降解率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 固定化時間對原油降解率的影響Fig.5 Effect of immobilizing time on the degradation rate of crude oil

由圖5 可知，固定化時間＜24 h，隨著固定化時間的增加，原油降解率逐漸增大;固定化時間為24 h時，原油降解率達(dá)到最大值;而24 h 后，隨著固定化時間的增加，原油降解率反而下降。這是由于初始階段，核桃殼有效孔隙率較大，固定化微生物量不斷增大;當(dāng)固定時間超過24 h 時，核桃殼孔隙中微生物過于密集，影響微生物活性的發(fā)揮，使原油降解率緩慢降低。

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗［20-21］

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，按Box-Behnken 設(shè)計實驗，其因素和水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

表2 實驗結(jié)果Table 2 Result of experiment

運用多元回歸分析方法對表2 數(shù)據(jù)擬合，可得原油降解 率模型:Y = 66. 54 + 4. 88A + 5. 03B－4.70C + 6. 44D－0. 93AB + 6. 32AC + 6. 19AD－4.49BC+2.98BD +4.83CD－12.64A2－13.60B2－10.90C2－14.23D2。

對響應(yīng)面二次模型方差分析和可信度估計及進(jìn)行F 檢驗，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface model

由表3 中模型的顯著系數(shù)(p ＜0.000 1)和失擬項顯著系數(shù)(p=0.124 4)可知，該模型可以準(zhǔn)確的預(yù)測不同組合條件下的原油降解率。該模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.983 4，表明預(yù)測值和實測值的擬合度較高，可用于實際值的分析［19］;Radj2=0.934 2 說明只有6.58%的變異不能通過該模型解釋，所以可以用預(yù)測值代替實測值對實驗結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。除原油質(zhì)量濃度和pH 值、固定化時間和pH 值的交互作用不顯著，其他所有回歸系數(shù)都是顯著的。其中，單因素對原油降解率的影響程度由高到低的順序為固定化時間、pH 值、原油質(zhì)量濃度和固定化混合菌投加量;交互作用對原油降解率的影響程度由高到低的順序為原油質(zhì)量濃度和固定化混合菌投加量、原油質(zhì)量濃度和固定化時間、固定化混合菌投加量和固定化時間、pH 值和固定化混合菌投加量。通過Design Expert 8.0.6 軟件，將4 因素兩兩進(jìn)行分析比較，做出響應(yīng)面曲線圖，見圖6 ～圖11。

圖6 原油初始質(zhì)量濃度和pH 值對原油降解率的交互影響圖Fig.6 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the mass concentration of crude oil and the pH value

圖7 原油初始質(zhì)量濃度和固定化混合菌投加量對原油降解率的交互影響圖Fig.7 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the mass concentration of crude oil and the dosage of immobilized mixed bacteria

圖8 原油初始質(zhì)量濃度和固定化時間對原油降解率的交互影響圖Fig.8 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the mass concentration of crude oil and the immobilizing time

圖9 pH 值和固定化混合菌投加量對原油降解率的交互影響圖Fig.9 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the pH value and the dosage of immobilized mixed bacteria

圖10 pH 值和固定化時間對原油降解率的交互影響圖Fig.10 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the pH value and the immobilizing time

圖11 固定化混合菌投加量和固定化時間對原油降解率的交互影響圖Fig.11 Response surface of crude oil degradation rate interaction between the dosage of immobilized mixed bacteria and the immobilizing time

2.7 預(yù)測模型的驗證

為得到最優(yōu)降解條件，借助Matlab 軟件對模型求解，得到固定化混合菌在原油質(zhì)量濃度4 300 mg/L，pH 值7. 9，固 定 化 混 合 菌 投 加 量27 g/L，微生物固定化時間28.5 h 時，理論最大原油降解率為68.89%。為了驗證模型的準(zhǔn)確性，用最佳降解條件進(jìn)行3 次平行實驗，得到固定化微生物對原油的平均降解率為69.94%，可見該模型能夠準(zhǔn)確的預(yù)測實際降解條件。

3 結(jié)論

低溫石油降解菌JA 和JB 對原油均具有良好的降解能力。固定化混合菌能顯著提高微生物對原油的去除效果，固定化混合菌降解原油的最佳工藝條件為:原油質(zhì)量濃度4 300 mg/L，pH 值7.9，JA∶JB=1∶2，固定化混合菌投加量27 g/L，固定化時間28.5 h，在該條件下，15%處理5 d 后，原油的降解率為69.94%。

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