李揚(yáng)，李夢(mèng)耀，袁勝，周旸

(1.長(zhǎng)安大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710054;2.長(zhǎng)安大學(xué) 陜西省地下水與生態(tài)環(huán)境工程研究中心，陜西 西安 710054)

黃酮類(lèi)化合物是一組存在于植物中的天然產(chǎn)物，葛根為豆科植物野葛的根，葛根的主要活性成分是大豆黃酮苷元、大豆苷、葛根素等多種異黃酮類(lèi)物質(zhì)，具有抗菌、活血化瘀、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管和腦血管、降低心肌耗氧量、改善心肌收縮功能、促進(jìn)血液循環(huán)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種藥理與保健作用［1-2］。葛根總黃酮作為許多藥物與保健品的主要功能成分具有重要的價(jià)值，其提取與功能應(yīng)用的研究是目前的熱點(diǎn)之一［3-5］。為了更好地開(kāi)發(fā)和利用葛根，本文就葛根總黃酮的提取與純化工藝研究進(jìn)行探究，以期為進(jìn)一步提高葛根資源的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。本文采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取法，以葛根作為提取原料，乙醇作為提取溶劑提取葛根中的黃酮。并利用LS-303 型樹(shù)脂進(jìn)行進(jìn)一步地分離純化，研究葛根黃酮在其上的吸附性能，通過(guò)不同條件下的靜態(tài)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于優(yōu)化生產(chǎn)工藝、提高分離效果，充分利用天然產(chǎn)品資源具有重要意義，尤其是為推廣大孔吸附樹(shù)脂純化法應(yīng)用于中藥制劑提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

葛根粉，購(gòu)于陜西西安市藥房，購(gòu)回后放入干燥處貯存;95%乙醇、無(wú)水乙醇、黃酮(蕓香葉苷)均為分析純;LS-303 樹(shù)脂，工業(yè)品。

752 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);WFZ-26A 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);AL204 電子天平;DK-98-1 型單列八孔水浴鍋;DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋;HY-2 調(diào)速多用振蕩器;320 pH 計(jì);101-2AB 型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 黃酮的分析方法

黃酮的測(cè)定方法選用紫外分光光度法，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)分別為255 nm 和350 nm。在一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與黃酮的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程分別為:A255=0. 029 2 c +0. 005 6，A350=0.022 0c+0.003 4。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葛根中黃酮的提取 有機(jī)溶劑提取法，以葛根粉為原料，乙醇為提取溶劑。稱(chēng)取一定量的葛根粉，加入適量的乙醇，在一定溫度下，靜置一段時(shí)間后取出，用微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到提取液。在提取過(guò)程中，采取單因素變量方法，針對(duì)提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、溫度4 個(gè)變量逐一進(jìn)行單因素變量實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取條件。計(jì)算葛根黃酮的提取率。

式中 R——葛根黃酮提取率，mg/g;

m1——樣品溶液中黃酮的質(zhì)量，mg;

m2——葛根粉質(zhì)量，g。

1.3.2 葛根中黃酮的純化 稱(chēng)取適量處理好的樹(shù)脂，用濕法裝柱法進(jìn)行裝柱，柱高7.5 cm。取一定量的葛根黃酮提取液，以一定流速通過(guò)柱子，檢測(cè)流出液中黃酮的濃度，即可計(jì)算出大孔樹(shù)脂對(duì)葛根黃酮的動(dòng)態(tài)吸附量及吸附率。當(dāng)達(dá)到吸附平衡后，再用60%乙醇進(jìn)行解吸，以一定流速通過(guò)柱子，檢測(cè)解吸液中黃酮的濃度，即可計(jì)算出大孔樹(shù)脂對(duì)葛根黃酮的解吸率。分別計(jì)算葛根黃酮的吸附率、解吸率以及動(dòng)態(tài)吸附量。

式中 R吸——葛根黃酮的動(dòng)態(tài)吸附率，%;

c0——黃酮提取液的初始濃度，μg/mL;

ce——黃酮提取液的平衡濃度，μg/mL。

式中 R解——葛根黃酮的動(dòng)態(tài)解吸率，%;

c解——解吸液中黃酮的濃度，μg/mL。

式中 Qe——葛根黃酮的吸附量，μg/g;

V——黃酮提取液的體積，mL;

w——樹(shù)脂的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 葛根中黃酮的提取

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 根據(jù)葛根中黃酮的提取方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g 研磨好的葛根粉，分別加入料液比為1∶16.7 g/mL，濃度為40%的乙醇溶液50 mL，60 ℃的條件下，分別提取0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，對(duì)不同提取時(shí)間提取液中黃酮的濃度進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算提取率(R)，對(duì)提取率隨提取時(shí)間的變化進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on yield

由圖1 可知，提取時(shí)間在0 ～1 h，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)葛根提取黃酮的提取率也迅速增加，提取時(shí)間在1 ～2.5 h，提取率趨于平緩，提取3 h 時(shí)提取率略有下降，可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致葛根黃酮氧化，從而使提取率降低。所以綜合各種因素，葛根黃酮最佳提取時(shí)間為1.5 h。

2.1.2 物料比對(duì)提取率的影響 其它提取條件不變，考察提取率隨物料比的變化，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 物料比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of material ratio on yield

由圖2 可知，料液比(g/mL)在1∶5 ～1∶8 時(shí)，提取率增加，料液比在1∶8 ～1∶16.7 時(shí)，提取率開(kāi)始下降?？紤]到成本則應(yīng)按1∶8，1∶13 料液比提取，葛根黃酮處于較高的提取率，但是按1∶8 料液比提取后，所得溶液較少，對(duì)于后期分離純化增加了難度，綜合考慮，選擇1∶13 為葛根黃酮最佳提取料液比。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響 提取率隨乙醇體積分率的變化見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on yield

由圖3 可知，隨著提取所用溶液濃度的升高，葛根黃酮的提取率增大，乙醇濃度達(dá)到60%時(shí)，葛根的提取率達(dá)到最大2.64 mg/g。而后，隨著乙醇濃度的增加，葛根黃酮的提取率略有降低，這可能是隨著其濃度增加，一些醇溶性雜質(zhì)和親脂性成分溶出量增加，這些成分和葛根黃酮競(jìng)爭(zhēng)同乙醇水分子結(jié)合，從而導(dǎo)致葛根黃酮提取效果的略有下降。同時(shí)考慮到成本因素，最佳乙醇提取濃度為40%。

2.1.4 提取溫度對(duì)提取率的影響 提取率隨提取溫度的變化見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on yield

由圖4 可知，隨提取溫度的升高，葛根黃酮的提取率升高。溫度升高有利于葛根黃酮擴(kuò)散到乙醇溶液中。因此，葛根黃酮的提取最佳溫度為60 ℃。

2.2 葛根中黃酮的純化

2.2.1 樹(shù)脂柱吸附及解吸 按照1.3 實(shí)驗(yàn)方法中的純化步驟進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)，取50 mL 葛根黃酮提取液，并測(cè)定其中黃酮的濃度，然后以2 mL/min的流速通過(guò)柱子，測(cè)定流出液中黃酮的濃度，計(jì)算大孔吸附樹(shù)脂對(duì)葛根黃酮的動(dòng)態(tài)吸附量;再用60%乙醇進(jìn)行解吸，以2 mL/min的流速通過(guò)柱子，測(cè)定解吸液中黃酮的濃度，計(jì)算大孔吸附樹(shù)脂對(duì)葛根黃酮的動(dòng)態(tài)解吸率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大孔吸附樹(shù)脂純化葛根黃酮Table 1 Purification of flavones from Kudzu root by macroporous adsorption resin

2.2.2 葛根黃酮純化液的吸收曲線(xiàn) 按照1.3 節(jié)的實(shí)驗(yàn)方法，將純化前后的葛根黃酮溶液分別稀釋10 倍后，在200 ～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，測(cè)定其紫外吸收曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 葛根黃酮溶液的紫外吸收曲線(xiàn)Fig.5 Adsorption spectra of flavones from Kudzu root

由圖5 可知，葛根黃酮提取液經(jīng)LS-303 型大孔吸附樹(shù)脂純化，其紫外吸收在黃酮特征波長(zhǎng)255 nm和350 nm 處峰形明顯變窄，表明葛根黃酮提取液經(jīng)LS-303 型大孔吸附樹(shù)脂純化后，雜質(zhì)含量明顯減少，黃酮純度提高。

3 結(jié)論

(1)乙醇水溶液提取葛根黃酮，單因素實(shí)驗(yàn)表明，95%乙醇體積濃度40%，料液比(葛根/提取劑)1∶13 g/mL，60 ℃提取1.5 h，葛根黃酮的提取率達(dá)到2.64 mg/g。

(2)葛根黃酮提取液可用LS-303 型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行純化，提取液經(jīng)LS-303 型大孔吸附樹(shù)脂純化后，雜質(zhì)含量明顯減少。

［1］ 張巖，薛興亞，徐青，等. 葛根提取物高效液相色譜分析方法的優(yōu)化［J］.色譜，2006，24(7):354-358.

［2］ 向大雄，李煥德，吳大勇，等. 不同純化工藝對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量的影響［J］.中國(guó)藥房，2002，13(6):328-330.

［3］ Yu Fu-Chieh，Lai Shih-Ming，Suen Shing-Yi.Extraction of flavonoid glycosides from ginkgo biloba leaves and their desorption separations using hydrophobic and anion-exchange membranes［J］.Separation Science and Technology，2003，38(5):1033-1050.

［4］ 陳亮.芹菜黃酮類(lèi)物質(zhì)提取與富集工藝研究［D］. 長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［5］ 劉翀，楊洋.生物類(lèi)黃酮提取研究進(jìn)展［J］.中外食品，2004(10):48-49.