林曉斌 徐燕510000廣東省廣州市番禺中心醫(yī)院

Mbd2基因在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)

林曉斌 徐燕
510000廣東省廣州市番禺中心醫(yī)院

目的：探討Mbd2在EM s患者發(fā)病過程中的可能作用。方法：Trizol法提取病變組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，Blast-primer設(shè)計(jì)Mbd2mRNA引物，Real-time PCR方法檢測各組間Mbd2mRNA表達(dá)變化。結(jié)果：EM s患者異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中Mbd2mRNA表達(dá)顯著高于子宮肌瘤患者在位內(nèi)膜（P＜0.01）；且EM s患者異位內(nèi)膜中Mbd2 mRNA的表達(dá)顯著高于在位內(nèi)膜（P＜0.01）。結(jié)論：Mbd2基因參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生，還可能為子宮內(nèi)膜異位癥的早期發(fā)現(xiàn)做出貢獻(xiàn)。

Mbd2；子宮內(nèi)膜異位癥；Real-time PCR

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是一種較為常見的婦科疾病，患者常表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛或性交痛，還可能合并不孕。其病因以及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，內(nèi)分泌、免疫、遺傳以及環(huán)境因素都可能與其有關(guān)。近年來，表觀遺傳學(xué)，尤其是DNA甲基化在EMs的發(fā)病機(jī)制中得到了廣泛關(guān)注[1]。

資料與方法

2014年3月-2015年4月收治因子宮肌瘤、卵巢巧克力囊腫行手術(shù)治療的子宮肌瘤患者30例，平均年齡（28.7±7.9）歲；EMs患者30例，平均年齡（29.2±8.6）歲。所有患者月經(jīng)規(guī)律，無宮內(nèi)節(jié)育器，手術(shù)前0.5年內(nèi)未曾服用抗炎或激素類藥物。所有組織均經(jīng)病理驗(yàn)證。標(biāo)本采集均得到患者本人或家屬知情授權(quán)，符合倫理標(biāo)準(zhǔn)。

主要試劑：Trizol、異丙醇、氯仿、75％乙醇、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、oligo dT、PCR引物、ABIPCRMix液。

主要儀器：ABI 7500 PCR儀、漩渦混合器、迷你離心機(jī)、低溫高速離心機(jī)、普通PCR儀、核酸定量儀。

試驗(yàn)方法：總RNA提取及檢測：嚴(yán)格按照Trizol說明書進(jìn)行操作，瓊脂糖電泳鑒定RNA的完整性，核酸定量儀檢測總RNAOD值，換算成微克。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：①反轉(zhuǎn)錄體系：2μ g總RNA，100 pmol oligo dT，5μL反轉(zhuǎn)錄buffer，0.625μL RNA酶抑制劑，1μLM-MLV酶，最后，DEPC水補(bǔ)充至25μL。②反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 60 min，95℃5min，4℃保存。

Real-time PCR：①引物序列：Gapdh：F：GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT，R：GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA；Mbd2：F：ACGAATGAATGAACAGCCACG， R： TGCTACCTGGACCAACTCCT。②反應(yīng)體系：12.5μL Abi PCRmix液，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，1.0μL cDNA，加水補(bǔ)足至25 μL。③反應(yīng)條件：階段1：50℃下2min；階段2：95℃10 min；階段3：95℃15 s，60℃60 s；階段4：收集溶解曲線條件95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。階段3 和4循環(huán)40次。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：本研究中采用SPSS 17.0軟件對計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用one-way ANOVA進(jìn)行各組間數(shù)據(jù)比較，P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

各組間Mbd2 mRNA的相對表達(dá)變化，見表1。

組間Mbd2mRNA的相對表達(dá)變化，見圖1。

討論

人類腫瘤細(xì)胞中DNA甲基化的改變可以視為腫瘤生物標(biāo)志之一[2]，而EMs與腫瘤具有非常類似的特性，比如細(xì)胞增殖、侵襲性及遷移等。目前學(xué)術(shù)界研究發(fā)現(xiàn)EMs可能是一種表觀遺傳學(xué)疾病[3]。

Mbd2（methyl-CpG-binding domain 2，Mbd2）是具有甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員之一，可與組蛋白去乙?；感纬蓮?fù)合體，抑制基因表達(dá)。目前認(rèn)為Mbd蛋白可以招募組蛋白去乙?；傅交蚪M上的甲基CpG富集區(qū)，從而抑制轉(zhuǎn)錄。另有報(bào)道顯示，Mbd2可以特異性地結(jié)合甲基化的DNA，可以從甲基化的基因啟動子區(qū)抑制轉(zhuǎn)錄的發(fā)生[4]。然而，有研究報(bào)道Mbd2可以起到去甲基化的作用，從而活化基因轉(zhuǎn)錄[5]，而DNA甲基化通常引起基因轉(zhuǎn)錄抑制。

表1 各組間Mbd2mRNA的相對表達(dá)變化（±s）

表1 各組間Mbd2mRNA的相對表達(dá)變化（±s）

注：與肌瘤在位內(nèi)膜比較，??P＜0.01；與EM s在位內(nèi)膜，##P＜0.01。

組別組 M bd2mRNA肌瘤在位內(nèi)膜 0.31±0.04 EM s在位內(nèi)膜 0.54±0.11??EM s異位內(nèi)膜 1.12±0.35??##

本次試驗(yàn)中，我們利用Real-Time PCR檢測了子宮肌瘤在位內(nèi)膜、EMs在位內(nèi)膜以及EMs異位內(nèi)膜組織中Mbd2 mRNA的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMs患者異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜中Mbd2mRNA表達(dá)顯著高于子宮肌瘤患者在位內(nèi)膜（P＜0.01）；且EMs患者異位內(nèi)膜中Mbd2mRNA的表達(dá)顯著高于在位內(nèi)膜（P＜0.01）。根據(jù)我們自己的試驗(yàn)結(jié)果以及他人研究發(fā)現(xiàn)，我們推測，在EMS發(fā)生過程中，Mbd2mRNA的表達(dá)上調(diào)抑制了某些具有類似于抑癌基因作用的基因的表達(dá)，使得子宮內(nèi)膜獲得了增殖、遷移以及定植的能力，從而發(fā)生了EMS或者加重了這一疾病過程。

圖1 各組間Mbd2 mRNA的相對表達(dá)變化

[1] 吳夏迪,曲娟,崔毓桂,等.表觀遺傳學(xué)和環(huán)境因素與子宮內(nèi)膜異位癥[J].國際生殖健康/計(jì)劃生育雜志,2015,34（1）：75-79.

[2] Wu Y,Strawn E,Basir Z,et al.Aberrant expression of deoxyribonucleic acid methyltransferases DNMT1,DNMT3A,and DNMT3B in women with endometriosis[J].Fertil Steril,2007,b（87）：24-32.

[3] 胡月陽,王芳,王俊霞.子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].發(fā)育醫(yī)學(xué)電子雜志,2014,2（4）：248-252.

[4] Zhu D,Hunter SB,Vertino PM,et al.Overexpression of MBD2 in glioblastomamaintains epigenetic silencing and inhibits the antiangiogenic function of the tumor suppressor gene BAI1[J].Cancer Res,2011,71：5859-5870.

[5] Fuso A,Nicolia V,Cavallaro RA,et al.DNA methylase and demethylase activities are modulated by one-carbonmetabolismin Alzheimer's diseasemodels[J].JNutr Biochem, 2011,22：242-251.

Expression of Mbd2 gene in patientsw ith endom etriosis uterina

Lin Xiaobin,Xu Yan
Panyu CentralHospitalofGuangzhou City,Guangdong Province 510000

Objective：To investigate the possible effectofMbd2 in the pathogenesis of EMs.Methods：General RNA was extracted from diseased tissues by Trizolmethod,then generated cDNA through reverse transcription.Mbd2mRNA primerwas designed by Blast-primer,and detected the expression of mRNA Mbd2 using Real-time PCR.Results：The expression of Mbd2 mRNA in ectopic endometrium and position intima of patients with EMs were significantly higher than those of patients with hysteromyoma（P＜0.01）；in patientswith Ems,the expression ofMbd2mRNA in ectopic endometrium was significantly higher than in position intima（P＜0.01）.Conclusion：Mbd2 gene involved in the occurrence ofendometriosisuterina andmay contribute to the early detection ofendometriosisuterina.

Mbd2；Endometriosisuterina；Real-time PCR

表1 兩組的Killip分級、LVEF等指標(biāo)對比（±s）

表1 兩組的Killip分級、LVEF等指標(biāo)對比（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05。

組別 例數(shù) cTnT（mg/m L） CK-MB（U/L） LVEF（％） Killip分級[例（％）]Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅱ級以上對照組 31 3.78±2.90 146.70±89.05 60.72±6.83 16（51.61） 13（41.94） 2（6.45）研究組 29 6.31±3.82＊ 197.51±97.10＊ 46.80±9.15＊ 12（41.38） 10（34.48） 7（24.18）＊

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.26.69