張盈瑩 朱黎娜 李韶深侯麗英 李會強 (天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床免疫學(xué)教研室,天津300203)
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血藍(lán)蛋白是中華絨鰲蟹重要的高分子量過敏原①
張盈瑩朱黎娜李韶深②侯麗英李會強(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床免疫學(xué)教研室,天津300203)
[摘要]目的:證明血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹的一種重要的高分子量過敏原。方法:采用裂解液法提取蟹總蛋白,通過SDS-PAGE、二維電泳及Western blot分析蟹中過敏原組分并進(jìn)行比對,再通過質(zhì)譜分析鑒定未知過敏原。以臨床中華絨螯蟹過敏患者的血清作為識別抗體,通過斑點免疫印記實驗證明疑似蛋白的致敏特性。結(jié)果:通過SDS-PAGE及二維電泳分析,證明本實驗所提取的蟹總蛋白組分完全。Western blot結(jié)果顯示,中華絨螯蟹至少有18種與陽性血清反應(yīng)的組分,其中,70~80 kD處兩個蛋白處于同一等電點,可能為同一蛋白,且反應(yīng)斑點清晰;質(zhì)譜分析結(jié)果顯示疑似蛋白為血藍(lán)蛋白;斑點免疫印記結(jié)果顯示血藍(lán)蛋白與患者血清的反應(yīng)頻率為61%。結(jié)論:血藍(lán)蛋白為中華絨鰲蟹中一種重要的高分子量過敏原。
[關(guān)鍵詞]中華絨鰲蟹;特異性sIgE;血藍(lán)蛋白;質(zhì)譜分析;過敏原
①本文為國家自然科學(xué)基金面上項目課題(No.81371882)。
②天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院,天津300120。
Hemocyanin is an important high-molecular-weight allergen of Eriocheir sinensis
ZHANG Ying-Ying,ZHU Li-Na,LI Shao-Shen,HOU Li-Ying,LI Hui-Qiang.College of Medical Laboratory,Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China
[Abstract]Objective: To prove hemocyanin is an important high-molecular-weight allergen from Eriocheir sinensis.Methods: The proteins were extracted from Eriocheir sinensis tissue with lysate extraction method .The protein components were analyzed by SDSPAGE,two-dimensional electrophoresis and Western blot.Serum IgE from allergic donors identified a candidate protein,which was characterized by MALDI-TOF/TOF.The immune property of the candidate protein was tested using Dot-blot.Results: By SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis analysis,we prove that the native protein components were completely.According to the Western blot result,at least 18 components could react with the positive serum.Among them,two 70-80 kD proteins had the same isoelectric point.So,may be they were the same protein.MALDI-TOF/TOF analysis results showed that the suspected proteins were hemocyanin.A sensitization frequency of 61% was observed in Eriocheir sinensis patients by Dot-blot.Conclusion: Hemocyanin was identified as an important high-molecular-weight allergen from Eriocheir sinensis.
[Key words]Eriocheir sinensis; Specific sIgE; Hemocyanin; MALDI-TOF/TOF analysis; Allergen
食物過敏是世界范圍內(nèi)常見的變態(tài)反應(yīng),近年來發(fā)病率不斷上升[1]。食物過敏是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型過敏反應(yīng),可引起腹瀉、嘔吐、水腫、皮炎、哮喘等臨床癥狀,嚴(yán)重可引起休克,甚至危及生命。流行病學(xué)研究表明:發(fā)達(dá)國家的成人食物過敏性疾病的患病率已高達(dá)3%,兒童為6%[2]。其中,甲殼類食物作為糧食農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization,F(xiàn)AO) /世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)認(rèn)定的8大過敏食物之一,被認(rèn)為是引起食物過敏的常見原因[3]。
與大多數(shù)的食物過敏不同,甲殼類食物通常引起的食物過敏是終生的,而且現(xiàn)在對于甲殼類食物過敏的治療,主要依靠于特異性免疫治療(Specific Immunotherapy,SIT),所以對甲殼類食物過敏組分的確定極其重要[4]。甲殼類食物中含有多種蛋白質(zhì),過敏原組分十分復(fù)雜[5]。其中,原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)是最早被發(fā)現(xiàn)的甲殼類動物過敏原[6,7]。近年來,精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈和肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白也相繼被鑒定為甲殼類食物的主要過敏原[8-10]。蟹是甲殼類食物的重要組成,種類繁多。中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)原產(chǎn)于中國,是中國特別是長江流域最經(jīng)濟(jì)、最重要的淡水水生物種之一。在2005年,中國中華絨螯蟹的產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了4.0×105t[11],而且在過去的十年中,隨著蟹文化的發(fā)展,中華絨螯蟹越來越受到人們的喜愛。因此,由中華絨螯蟹引起的食物過敏在我國較為常見?,F(xiàn)已報道的中華絨螯蟹的主要過敏原只有原肌球蛋白和精氨酸激酶[12],對其他的過敏原組分未見報道[13]。
我們先前對梭子蟹過敏原的分析中,發(fā)現(xiàn)除了已明確的36 kD、40 kD的原肌球蛋白、精氨酸激酶外,高分子量的蛋白也占有很大比例。其中,70 kD 和74 kD的蛋白百分比最高,且與過敏患者血清反應(yīng),顯示多條反應(yīng)條帶,且顏色較深[14]。由此,本文探究在中華絨螯蟹中,高分子量蛋白是否也是重要的過敏原,并進(jìn)一步豐富人類對中華絨螯蟹過敏組分的認(rèn)識。
1.1材料
1.1.1儀器垂直板型電泳儀、電轉(zhuǎn)印槽、二維電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司) ;低溫高速冷凍離心機(Beckman公司) ;凝膠成像系統(tǒng)(ChampGel公司)。
1.1.2試劑硫脲、碘乙酰胺、載體兩性電解質(zhì)IPG-buffer、pH為3~10的干膠條購自于美國GE公司;血藍(lán)蛋白、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、吐溫-20(Tween-20)均購自美國Sigma公司;蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)SM0671(加拿大Fermentas公司) ;聚偏二氟乙烯(PVDF) (美國Millipore公司) ;鼠抗人IgE-AP抗體、鼠抗人IgE-HRP抗體(美國Jackson Immunoresearch公司)。
1.2方法
1.2.1血清標(biāo)本隨機選取天津市長征醫(yī)院的蟹過敏患者23例,男14例,女9例,陽性血清納入標(biāo)準(zhǔn)為患者有典型過敏史,臨床確診為蟹類過敏,血清總IgE>100 kU/L,血清蟹sIgE>0.35 kU/L等。陰性對照血清來自健康體檢人群,納入標(biāo)準(zhǔn)為無過敏家族史,無食物過敏史,血清總IgE<100 kU/L。采集研究對象靜脈血,分離血清并分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2蟹總蛋白的提取中華絨螯蟹購買自天津市三義莊菜市場,現(xiàn)殺去殼、取肌肉組織。取5 g新鮮中華絨螯蟹肌肉組織,剪碎,在液氮中充分研磨至粉末狀,用勻漿器勻漿,加入5 ml裂解液[7 mol/L尿素,2 mol/L硫脲,4%(w/v) CHAPS,65 mmol/L DTT,40 mmol/L Tris],震蕩混勻后,于冰上靜置30 min,使蛋白質(zhì)充分溶解到裂解液中。使用低溫高速冷凍離心機于4℃下12 000 r/min離心30 min,取上清液即為蟹總蛋白粗提液。分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 SDS-PAGE及二維電泳分析采用SDSPAGE技術(shù),用不連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行垂直板電泳,對蟹總蛋白粗提液組分進(jìn)行分析。濃縮膠為5%,分離膠為10%,蛋白樣品與上樣緩沖液1∶5混合,煮沸5 min,每孔上樣12 μl,65 V恒壓堆積20 min,135 V恒壓分離,待溴酚藍(lán)指示到達(dá)分離膠底部,電泳完畢,考馬斯亮藍(lán)染色1 h,脫色液充分洗脫。
參照文獻(xiàn)[15]方法,采用二維電泳進(jìn)一步對蟹總蛋白粗提液進(jìn)行分析。水化上樣及第一向等電聚焦:取100 μl蟹蛋白粗提液與400 μl水化上樣緩沖液混合,沿膠條槽自左而右均勻加入125 μl樣品,由陽性端開始放下膠條,慢慢覆蓋在蛋白樣品上,并輕輕趕走膠條下的氣泡,使水化液浸濕整個膠條,然后在膠條上緩慢覆蓋2 ml礦物油。蓋上蓋子,設(shè)定等電聚焦程序。膠條的平衡與第二向SDS-PAGE電泳:將膠條取出,分別在平衡緩沖液Ⅰ和平衡緩沖液Ⅱ中平衡10 min后,備用。制備10%的分離膠,待充分凝固后,用約50℃的0.5%低熔點瓊脂糖封膠液灌入玻璃板縫隙中,輕輕把膠條推到分離膠面上,待瓊脂糖凝固后,即可開始電泳。65 V恒壓10 min,135 V恒壓分離,直到溴酚藍(lán)跑到玻璃板底部為止??捡R斯亮藍(lán)染色1 h,脫色液充分洗脫。拍照,分析。
1.2.4 Western blot分析將蟹蛋白粗提液分別進(jìn)行一維、二維電泳后,采用半干轉(zhuǎn)方法,15 V恒壓,轉(zhuǎn)印30 min,將蟹蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,然后置于5%的脫脂奶中室溫封閉2 h,用TBST洗3次,每次10 min。加入用TBST 1∶9稀釋的單例陽性血清,4℃反應(yīng)過夜,用TBST洗3次,每次10 min。加入1∶1 000稀釋的鼠抗人IgE-AP作為標(biāo)記二抗,室溫反應(yīng)2 h。TBST洗3次,每次10 min,加入AP底物避光顯色10 min,將膜取出用蒸餾水洗凈,吹干后觀察顯色點。
1.2.5質(zhì)譜分析將二維電泳上疑似過敏原進(jìn)行摳點、漂洗、脫色、脫水、干燥、膠內(nèi)酶切、肽段的抽提和純化等步驟,得到的樣品由北京蛋白質(zhì)組研究中心協(xié)助用蛋白質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)進(jìn)行檢測,獲得被檢測樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜。利用Mascot軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫,尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)。
1.2.6斑點免疫印記以血藍(lán)蛋白作為包被抗原,陽性血清sIgE作為識別抗體,進(jìn)行斑點免疫印記實驗。方法如下:將血藍(lán)蛋白用0.01 mol/L PBS溶解,終濃度為5 mg/ml。將2 μl血藍(lán)蛋白點于NC膜上,待其干燥,羊抗鼠IgG作為陽性對照,PBS作為陰性對照。用TBST洗10 min,然后將NC膜放入5%的脫脂奶中室溫封閉2 h,TBST洗3次,每次10 min。將封閉好的NC膜分別與24份1∶9稀釋的陽性及陰性血清室溫反應(yīng)2 h,TBST洗三次,每次10 min。加入1∶1 000稀釋的鼠抗人IgE-HRP作為二抗,室溫反應(yīng)2 h。TBST洗3次,每次10 min,曝光,觀察結(jié)果。
2.1蟹蛋白粗提液蛋白組分分析蟹蛋白粗提液的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示,至少有18條明顯的蛋白條帶。其中,20、34、40 kD處分別為已知的肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶。在70~90 kD之間有四條明顯的條帶,但該分子量范圍內(nèi)的蛋白尚未見相關(guān)報道。二維電泳分析結(jié)果與SDSPAGE結(jié)果一致,大部分蛋白組分的等電點在4~9之間,其中,25~45 kD之間的蛋白著色最深,含量最豐富,應(yīng)多為已報道的原肌球蛋白及精氨酸激酶。在等電點5.2、70~80 kD處可分辨兩個明顯的點。結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果相符。
2.2蟹中過敏組分分析蟹總蛋白提取液經(jīng)一維印記分析,結(jié)果如圖2A所示,中華絨螯蟹過敏原中,除34 kD原肌球蛋白、40 kD精氨酸激酶外,55 kD以上的高分子量蛋白占有很大比例,且70~80 kD處反應(yīng)條帶較深。利用二維印記,使用混合陽性血清作為探針進(jìn)一步分析,結(jié)果如圖2B所示,25~45 kD處出現(xiàn)多個陽性反應(yīng)點,與已報道的研究結(jié)果相符。同時,70~80 kD處出現(xiàn)了陽性反應(yīng)點,證明該處蛋白是中華絨螯蟹中的過敏原。
Note: A.Western-blot analysis of extract of Eriocheir sinensis proteins.M.Marker; 1-6.Sera from 6 crab-allergic subjects; N.Negative serum; B.Two-dimensional Western blot analysis of extract of Eriocheir sinensis proteins.1.Suspected proteins.
圖3 疑似蛋白肽指紋圖譜Fig.3 Peptide Mass Finger Print of suspected proteins
2.3質(zhì)譜分析結(jié)果對二維電泳70~90 kD處兩個蛋白點進(jìn)行質(zhì)譜分析,肽指紋圖譜及質(zhì)譜結(jié)果如圖3、表1所示,其中,圖3A為疑似蛋白1,普庫索取號為gi|334145788,預(yù)測分子量為78 390,等電點約為5.21,Mascot得分為107,有16個肽段可與中華絨螯蟹血藍(lán)蛋白匹配;圖3B為疑似蛋白2,Mascot得分為209,有29個肽段可以與中華絨螯蟹血藍(lán)蛋白匹配。
3.4斑點免疫印記實驗結(jié)果使用血藍(lán)蛋白作為包被抗原,進(jìn)行斑點免疫印記實驗,結(jié)果如圖4所示,在23例陽性血清中,14例與血藍(lán)蛋白反應(yīng),9例無反應(yīng)。血藍(lán)蛋白的反應(yīng)率為61%。
表1 匹配片段質(zhì)譜分析結(jié)果Tab.1 MALDI-TOF/TOF results of matched peptides
Note: 1-23.Hemocyanin react with Sera from 23 crab-allergic subjects; P.Positive control; N.Negative control.
然而,由于蟹中含有極其豐富的蛋白質(zhì),且蛋白種類繁多,其中致敏原組分尚未完全揭示。通過與蟹過敏病人血清的Western blot實驗發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹中可與血清sIgE結(jié)合的過敏原組分多種多樣,且尚未完全被闡明。本文的主要目的就是探尋中華絨螯蟹中未報道的過敏原。
通過SDS-PAGE分析,蟹總蛋白粗提液包含20、36、40、113 kD等主要過敏原,蛋白組份完整,且蛋白條帶清晰,說明我們的蟹總蛋白粗提液可用于后續(xù)研究。除已報道的幾種過敏原外,在70~90 kD間,有四條明顯的蛋白條帶,且該區(qū)域蛋白尚未見報道。隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù)的逐步完善,雙向電泳和質(zhì)譜的聯(lián)用已成為蛋白分析的核心技術(shù),因此,我們采用二維電泳技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)該分子量范圍內(nèi)的兩個蛋白在同一等電點,推測可能為同一種蛋白。用混合陽性血清作為識別抗體,發(fā)現(xiàn)該處蛋白可與陽性血清反應(yīng),證明該蛋白為中華絨螯蟹的一種過敏原。胰酶消化后,對該處蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析,該處蛋白與中華絨螯蟹中血藍(lán)蛋白相匹配,且Mascot得分均較高,證明該處蛋白均為血藍(lán)蛋白,即血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹的一種新型過敏原。
血藍(lán)蛋白(Hemocyanin)是許多軟體動物、節(jié)肢動物中一種的運輸糖蛋白,具有酚氧化物酶活性和抗菌、抗癌功能,被認(rèn)為是一種重要的免疫分子[18]。中華絨螯蟹中血藍(lán)蛋白[19]cDNA長2 573 bp,其中2 064 bp為開放閱讀框,編碼688個氨基酸,計算得到的分子量為77 997.31 Da,理論上的PI值為4.93,血藍(lán)蛋白與血紅蛋白分子類似,也是一種多亞基組成的分子。
為了評估血藍(lán)蛋白是否為中華絨螯蟹中的主要過敏原,我們需要確定血藍(lán)蛋白與陽性血清的反應(yīng)率。我們用血藍(lán)蛋白作為包被抗原,進(jìn)行斑點印記實驗,發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白的反應(yīng)率為61%,證實血藍(lán)蛋白為中華絨螯蟹的一種主要的過敏原。本文通過SDS-PAGE、二維電泳及Western blot分析蟹中過敏原組分并進(jìn)行比對,再通過質(zhì)譜分析鑒定中華絨螯蟹中70~90 kD處新型的過敏原———血藍(lán)蛋白,并通過斑點免疫印記實驗證明血藍(lán)蛋白是中華絨螯蟹中的一種主要的過敏原。同時,探索了鑒定過敏原的方法,為中華絨螯蟹其他新型過敏原的發(fā)現(xiàn)、研究奠定了基礎(chǔ)。更重要的是,通過對蟹類過敏原認(rèn)識的深入,為過敏性疾病的檢測提供更標(biāo)準(zhǔn)化、高質(zhì)量的已知抗原,為研制新一代的檢測試劑提供實驗依據(jù)。
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在針對猝死病人進(jìn)行搶救的過程中,心肺復(fù)蘇是最有效的手段也是唯一的途徑,在臨床實踐中,開展心肺復(fù)蘇并在心肺復(fù)蘇過程中加強治療,能夠改善患者的身體狀態(tài),為后續(xù)治療做好準(zhǔn)備工作。因此新時期十分有必要對心肺復(fù)蘇中西醫(yī)結(jié)合治療熱點進(jìn)行分析,為進(jìn)一步提高心肺復(fù)蘇綜合水平提供相應(yīng)的支持。
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[收稿2015-01-20修回2015-04-22]
(編輯張曉舟)
doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.10.017
通訊作者及指導(dǎo)教師:李會強(1965年-),男,教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事標(biāo)記免疫分析方法學(xué)和食物過敏實驗室診斷領(lǐng)域的研究,E-mail: lihuiqiang1965@ 163.com。
作者簡介:張盈瑩(1991年-),女,主要從事食物過敏實驗室診斷領(lǐng)域的研究。
文章編號1000-484X(2015) 10-1375-06
文獻(xiàn)標(biāo)志碼A
中圖分類號R392.11