馬　莉　沈　燕　(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州450052)

?

NF-κB P65 siRNA對IL-17誘導(dǎo)下MCP-1表達的影響作用

馬莉沈燕(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州450052)

［摘要］目的:研究NF-κB P65 siRNA對IL-17誘導(dǎo)下心肌細胞MCP-1表達的影響作用。方法:差速貼壁法分離乳鼠心肌細胞進行原代培養(yǎng)。利用陽離子脂質(zhì)體將NF-κB P65 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染入小鼠心肌細胞，熒光定量RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別檢測NF-κB P65 siRNA對IL-17誘導(dǎo)下MCP-1 mRNA和蛋白的含量變化。熒光定量RT-PCR和Western blot檢測IL-17作用下P-P65和P65 mRNA和蛋白含量變化。結(jié)果:與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA+IL-17組MCP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯增加(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染NF-κB P65 siRNA組MCP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA+IL-17組相比，轉(zhuǎn)染NF-κB P65 siRNA+IL-17組MCP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)。NF-κB P65 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，NF-κB P65在基因及蛋白水平表達均被明顯抑制(P＜0.05)。IL-17作用心肌細胞不同時間后，檢測發(fā)現(xiàn)隨時間增加P-P65蛋白含量逐漸增加，15 min到達高峰，隨后逐漸下降，各作用時間與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而P65蛋白含量變化不大，各作用時間與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論: IL-17可以通過促進心肌細胞內(nèi)NF-κB P65磷酸化上調(diào)MCP-1的表達，而NF-κB P65 siRNA能夠通過沉默P65基因表達有效抑制IL-17對MCP-1的上調(diào)作用。

［關(guān)鍵詞］白介素17;單核細胞趨化蛋白1;病毒性心肌炎;核轉(zhuǎn)錄因子kappa B ;小干擾RNA

Role of NF-κB siRNA in MCP-1 levels induced by IL-17 stimulation in cardiac myocytes

MA Li，SHEN Yan.Department of Clinical Laboratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China

［Abstract］Objective: To investigate the effect of NF-κB p65siRNA of IL-17 inducing the expression of MCP-1 in the primary cultured cardiac myocytes.Methods: The cardiac myocytes were isolated from neonatal mice by different adhesion method.NF-κB P65 siRNA was transfected into cardiac myocytes and the rates of transcription and translation of MCP-1 were detected by RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，the rates of transcription and translation of P-P65 and P65 were detected by RT-PCR and Western blot.Results: Compared with negative siRNA group，the expression of the MCP-1 at mRNA and protein levels were increased in negative siRNA +IL-17 group(P＜0.05) .Compared with negative siRNA group，the expression of the MCP-1 at mRNA and protein levels were decreased in NF-κB P65 siRNA group(P＜0.05) .Compared with negative siRNA+IL-17 group，the expression of the MCP-1 at mRNA and protein levels were decreased in NF-κB P65 siRNA+IL-17 group(P＜0.05) .The expression of the NF-κB P65 at mRNA and protein levels in cardiac myocytes were specifically and extensively suppressed by NF-κB P65 siRNA(P＜0.05) .After stimulated by IL-17，the amount of P-P65 in the cardiac myocytes was significantly increased in time-dependent manner compared with that of black group(P＜0.05)，but the levels of P65 changed little(P＞0.05) .Conclusion: IL-17 stimulates MCP-1 expression in cardiac myocytes via NF-κB activation，and NF-κB P65 siRNA can effectively inhibit the upregulation of IL-17 on MCP-1.

［Key words］IL-17 ; MCP-1; VMC; NF-κB ; Small interfering RNA

IL-17是一種重要的促炎細胞因子，可以通過與相應(yīng)的受體(IL-17R)結(jié)合，激活靶細胞產(chǎn)生各種炎癥細胞因子，從而介導(dǎo)炎癥細胞到達局部引起組織損傷［1］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)單核細胞趨化因子-1 (Monocyte chemoattractant protein1，MCP-1)在病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)心肌組織單個核細胞浸潤中起重要作用［2，3］，并發(fā)現(xiàn)IL-17能夠上調(diào)心肌細胞中MCP-1的表達［4］，但是IL-17通過哪種轉(zhuǎn)錄因子及信號通路上調(diào)心肌細胞中MCP-1的表達目前尚不清楚。NF-κB是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子［5］，Chen等［6］研究發(fā)現(xiàn)IL-17可以激活巨噬細胞中NF-κB，Wang等［7］研究發(fā)現(xiàn)抑制大鼠系膜細胞中NF-κB的表達或激活可以抑制MCP-1的表達。但關(guān)于IL-17是否通過NF-κB上調(diào)心肌細胞中MCP-1表達尚未見文獻報道。本研究通過利用RNA干擾技術(shù)特異性的抑制心肌細胞中NF-κB的表達，研究NF-κB siRNA對IL-17誘導(dǎo)心肌細胞中MCP-1表達的抑制作用，研究心肌細胞IL-17上調(diào)MCP-1中可能的轉(zhuǎn)錄因子，為病毒性心肌炎的防治提供一種新的生物治療方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物1～3 d齡BALB/c乳鼠，SPF級實驗動物，購于河南省實驗動物中心。

1.1.2主要試劑胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司) ;胰酶、D-hank' s液、雙抗溶液(Solarbio公司) ; 5-溴脫氧尿苷(Sigma公司) ;重組小鼠IL-17(Peprotech公司) ;小鼠MCP-1 ELISA檢測試劑盒、核蛋白提取試劑盒、總蛋白提取試劑盒(武漢博士德公司) ; P65、P-P65和GAPDH抗體及二抗(Santa Cruz) ; Trizol試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司) ;熒光定量PCR試劑(北京康為世紀生物科技有限公司) ; siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑(上海吉瑪基因生物) ;細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板(耐思生物科技有限公司) ; DEPC水、PCR一次性耗材(上海生工公司) ; PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1心肌細胞的分離與培養(yǎng)無菌條件下取3 d以內(nèi)BALB/c乳鼠心臟，放入預(yù)冷的D-Hank's液平皿中沖洗，剪成1 mm3左右碎片后沖洗并移入內(nèi)置磁性攪拌子的50 ml三角瓶中，瓶內(nèi)加入10 ml 0.08%胰蛋白酶37℃80 r/min攪動10 min。首次懸液棄去以后所得細胞懸液用等量含20%胎牛血清的培養(yǎng)基中止消化，200目篩網(wǎng)過濾后1 000 r/ min 10 min后重懸，接種于培養(yǎng)瓶，5%CO2，37℃培養(yǎng)90 min進行差速貼壁。收集含有未貼壁的心肌細胞培養(yǎng)液，細胞計數(shù)，將細胞密度調(diào)整為(2×104～3×104) ml－1后接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)3 d即可用于實驗。

1.2.2 siRNA序列的設(shè)計合成siRNA由銳博生物科技有限公司設(shè)計合成，包括目的基因NF-κBP65 siRNA:正義鏈5-GGAGUACCCUGAAGCUAUATT-3，反義鏈5-UAUAGCUUCAGGGUACUCCAT-3陰性對照siRNA:正義鏈5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反義鏈5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。

1.2.3 siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染siRNA于原代心肌細胞

取3 μl 1 mol/L的siRNA oligo溶液加入到100 μl無血清DMEM/F12，孵育5 min后，加入2 μl siRNAMateTM形成siRNA oligo-siRNA-Mate復(fù)合物。將復(fù)合物滴加到更換過培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育24～48 h。

1.2.4實時熒光定量RT-PCR檢測心肌細胞MCP-1和P65 mRNA含量按Trizol說明書操作方法提取心肌細胞總RNA，Nano-Drop2000紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。按照PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進行操作，以O(shè)lig(dt)為引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。LightCycler 480檢測并計算Ct值。擴增結(jié)束后，進行溶解曲線分析。采用相對定量的方法(2－△△Ct)來表示MCP-1 和P65的相對表達量。NF-κB-P65:上游引物5-TGATGTGCATCGGCAAGTG-3，下游引物5-AGAAGTTGAGTTTCGGGTAG-3; MCP-1:上游引物5-CGGAATTCGCCACCATGCAGGTCCCTGTCAT-3，下游引物5-GCTCTAGACTAGTTCACTGTCACACT-3; GAPDH:上游引物5-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3，下游引物5-GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3。

1.2.5 ELISA檢測心肌細胞培養(yǎng)上清中MCP-1蛋白含量收集細胞培養(yǎng)上清，2 000 r /min離心15 min，－80℃保存待測。根據(jù)小鼠MCP-1 ELISA檢測試劑盒操作說明書將標準品進行系列稀釋，繪制標準曲線。將待測標本室溫平衡，經(jīng)加樣，溫育，洗板，顯色等步驟后終止反應(yīng)。用酶標儀450nm處測定各孔A值，通過標準曲線計算出待測標本中MCP-1的濃度。

1.2.6 Western blot檢測P-P65和P65蛋白含量收集各組細胞，按試劑盒說明提取總蛋白和核蛋白后進行蛋白定量(BCA法)。取各樣品30 μg加入上樣緩沖液，95℃變性5 min，10%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜后，加相應(yīng)二抗孵育2 h，TBST洗滌10 min×3次后ECL法發(fā)光，暗室曝光、顯影、洗片，軟件分析條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法用SSPS13.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)庫，計量資料結(jié)果用x ±s表示，組間比較用單因素方差分析及LSD-t檢驗，檢測結(jié)果P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 NF-κB P65 siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞后對IL-17誘導(dǎo)下MCP-1表達的影響作用與空白對照組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組MCP-1 mRNA和蛋白表達水平無明顯差異(P＞0.05)。與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染NF-κB P65 siRNA組MCP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA+IL-17組MCP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)染陰性對

表1　 ELISA檢測心肌細胞MCP-1蛋白表達(x ±s，n=3)Tab．1 MCP-1 protein expression in cardiac myocytes detected by ELISA(x±s，n=3)

圖1　逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測心肌細胞MCP-1 mRNA表達Fig．1 MCP-1 mRNA expression in cardiac myocytes detected by FQ-RT-PCR

Note: 1.Blank group; 2.Negative siRNA group; 3.NF-κB P65 siRNA group; 4.Negative siRNA+IL-17 group; 5.NF-κB P65 siRNA+IL-17 group.Compared with Blank group，* .P＞0.05; compared with Negative siRNA group，#.P＜0.05; compared with NF-κB P65 siRNA group，Δ.P＜0.05.

圖3　熒光定量RT-PCR檢測心肌細胞P65 mRNA表達Fig．3 P65 mRNA expression in cardiac myocytes detected by FQ-RT-PCR

圖4　 Western blot檢測心肌細胞P65蛋白表達Fig．4 P65 protein expression in cardiac myocytes detected by Western blot

照siRNA+IL-17組相比，轉(zhuǎn)染NF-κB P65 siRNA+IL-17組MCP-1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，詳見表1、圖1、2。

2.2 NF-κB P65 siRNA轉(zhuǎn)染心肌細胞后對P65 mRNA和蛋白表達的影響作用與空白對照相比，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組P65 mRNA和蛋白表達水平無明顯差異(P＞0.05)。與轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA組相比，轉(zhuǎn)染NF-κB P65 siRNA組P65 mRNA和蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3、4。

2.3心肌細胞中IL-17作用不同時間對P-P65和P65蛋白含量變化的影響P-P65蛋白含量隨時間增加而逐漸增加，15 min到達高峰，隨后逐漸下降，各作用時間與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。P65蛋白含量隨時間增加變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，見圖5。

Note: Compared with controls，* .P＜0.05; compared with controls，#.P＞0.05.

3　討論

VMC是病毒感染引起的彌漫性或局限性心肌炎性病變，由于其發(fā)病機制還不完全清楚，目前仍沒有非常有效的治療方式。通常認為在病毒感染初期，病毒可直接侵害心肌［8，9］，但嚴重的持久的心肌病變卻是由心肌細胞自身免疫介導(dǎo)的［10，11］。目前，在抗炎治療的研究中細胞因子受到普遍關(guān)注，但單純的拮抗炎性細胞因子效果并不佳，因此對其炎癥信號通路進行研究，尋找可能的轉(zhuǎn)錄因子作為干預(yù)靶點極為重要。NF-κB在調(diào)控炎癥反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，是目前研究的熱點。靜息狀態(tài)下NF-κB與IκB結(jié)合，以無活性狀態(tài)存在于胞漿內(nèi)。當細胞受細胞外信號刺激后，IκB激酶復(fù)合體(IκB kinase，IKK)活化將IκB磷酸化使NF-κB暴露核定位位點。游離的NF-κB磷酸化后進入細胞核，與特異性DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，只有激活的NF-κB才能參與炎癥的基因調(diào)控。Gui等［12］研究證實，抑制NF-κB信號可明顯緩解CVB3誘導(dǎo)的心肌炎。但關(guān)于IL-17是否通過NF-κB上調(diào)心肌細胞中MCP-1表達尚未見文獻報道。

為了研究NF-κB在IL-17上調(diào)MCP-1中的作用，我們將小鼠心肌細胞中NF-κB P65沉默處理后再予以IL-17誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)MCP-1在基因及蛋白水平均受到明顯抑制，說明IL-17對MCP-1的上調(diào)作用能夠被NF-κB P65 siRNA所抑制。同時利用RTPCR和Western blot分別檢測NF-κB P65 siRNA干擾作用下P65的變化情況及與對照組的差異，發(fā)現(xiàn)NF-κB P65 siRNA的導(dǎo)入使小鼠心肌細胞中NF-κB P65在基因及蛋白水平均受到明顯抑制，表明NF-κB P65 siRNA可以有效沉默P65基因的表達。為了研究IL-17對心肌細胞中NF-κB的激活作用，我們將小鼠心肌細胞用IL-17作用不同時間后分別檢測P65和P-P65蛋白含量變化，發(fā)現(xiàn)P-P65蛋白含量隨時間增加而逐漸增加，15 min到達高峰，隨后逐漸下降，而P65蛋白含量無明顯改變，表明IL-17是通過促進P65磷酸化而不是通過誘導(dǎo)P65表達來上調(diào)MCP-1表達的。綜上我們推測在VMC炎癥反應(yīng)中NF-κB的活化對于調(diào)節(jié)IL-17誘導(dǎo)下MCP-1對心肌細胞的炎癥損傷起關(guān)鍵作用，NF-κB P65 siRNA能夠有效地抑制MCP-1的表達從而減輕心肌細胞的損傷，為VMC免疫性損傷的治療提供了新的思路。

有研究報道IL-17可以通過多條信號傳導(dǎo)途徑激活NF-κB［13，14］，我們推測ACT1/TRAF6/TAK1信號傳導(dǎo)途徑是IL-17上調(diào)MCP-1表達的最可能的信號傳導(dǎo)通路，而具體實際情況尚需更深入的研究?？傊?，研究IL-17上調(diào)心肌細胞MCP-1表達的信號通路，可以為我們進一步揭示VMC的發(fā)病機制提供重要依據(jù)，為臨床治療提供新的思路。

參考文獻:

［1］Yang J，Sundrud MS，Skepner J，et al．Targeting Th17 cells in autoimmune diseases［J］．Trends Pharmacol Sci，2014，35 (10) : 493-500.

［2］沈燕，陳瑞珍，儲以微，等.CVB3感染通過MCP-1介導(dǎo)病毒性心肌炎小鼠單個核細胞遷移［J］．中國免疫學(xué)雜志，2005，21 (5) : 325-328.

［3］Shen Y，Zhang FQ，Wei X.Truncated monocyte chemoattractant protein-1 can alleviate cardiac injury in mice with viral myocarditis via infiltration of mononuclear cells［J］．Microbiol Immunol，2014，58(3) : 195-201.

［4］劉艷月，李燕燕，王珊珊，等.IL-17對心肌細胞單核細胞趨化蛋白-1表達的影響［J］．細胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28(2) : 163-166.

［5］Bhatt D，Ghosh S.Regulation of the NF-κB-mediated transcription of inflammatory genes［J］．Front Immunol，2014，5(71) : 1-9.

［6］Chen J，Liao M，Gao X，et al．IL-17A induces pro-inflammatory cytokines production in macrophages via MAPKinases，NF-κB and AP-1［J］．Cell Physiol Biochem，2013，32(5) : 1265-1274.

［7］Wang J，Zhao Y，Chen S，et al．AOPPs induce MCP-1 expression by increasing ROS-mediated activation of the NF-κB pathway in rat mesangial cells: inhibition by sesquiterpene lactones［J］．Cell Physiol Biochem，2013，32(6) : 1867-1877.

［8］Huber M，Watson KA，Selinka HC，et al．Cleavage of RasGAP and phosphorylation of mitogen-activated protein kinase in the course of coxsackievirus B3 replication［J］．J Virol，1999，73 (5 ) : 3587-3594.

［9］Luo H，Yanagawa B，Zhang J，et al．Coxsackievirus B3 replication is reduced by inhibition of the extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling pathway［J］．J Virol，2002，76(7) : 3365-3373.

［10］Castellano G，Affuso F，Di Conza P，et al．Myocarditis and dilated cardiomyopathy: possible connections and treatments［J］．J Cardiovasc Med(Hagerstown)，2008，9(7) : 666-671.

［11］Rose NR.Myocarditis: infection versus autoimmunity［J］．J Clin Immunol，2009，29(6) : 730-737.

［12］Gui J，Yue Y，Chen R，et al．A20(TNFAIP3) alleviates CVB3-induced myocarditis via inhibiting NF-kappaB signaling［J］．PLoS One，2012，7(9) : e46515.

［13］Cortez DM，F(xiàn)eldman MD，Mummidi S，et al．IL-17 stimulates MMP-1 expression in primary human cardiac fibroblasts via p38 MAPK-and ERK1/2-dependent C/EBP-beta，NF-kappaB，and AP-1 activation［J］．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293 (6) : H3356-H3365.

［14］Huang F，Kao CY，Wachi S，et al．Requirement for both JAK-mediated PI3K signaling and ACT1/TRAF6/TAK1-dependent NF-kappaB activation by IL-17A in enhancing cytokine expression in human airway epithelial cells［J］．J Immunol，2007，179(10) : 6504-6513.

［收稿2015-04-02修回2015-05-14］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．008

通訊作者及指導(dǎo)教師:沈燕(1966年－)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事臨床分子診斷與免疫學(xué)方面研究，E-mail: shenyan62687@ 163．com。

作者簡介:馬莉(1990年－)，女，主要從事臨床分子診斷與免疫學(xué)方面研究，E-mail: 18446940@ qq．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1333-05

文獻標志碼A

中圖分類號R392.11