賈　原　李文麗　李　芳　趙　晴　張俊萍(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科(生物治療)，太原030032)

?

維生素C對(duì)DC細(xì)胞功能調(diào)控影響研究①

賈原李文麗李芳趙晴張俊萍②
(山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院山西大醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科(生物治療)，太原030032)

［摘要］目的:探討維生素C(VC)對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)的影響，并檢測(cè)DC細(xì)胞成熟情況，為快速制備DC疫苗提供一種可行方法及思路。方法:采集健康志愿者外周血50 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血PBMC，貼壁后獲得單核細(xì)胞。用不同濃度VC對(duì)DC進(jìn)行孵育(24 h)，后經(jīng)PBS洗滌，并設(shè)立空白對(duì)照組(V0)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面共刺激分子CD80/86及HLA-DR，CD40表達(dá)情況。通過設(shè)置VC濃度梯度及時(shí)間梯度，考察VC對(duì)DC刺激的最佳濃度及最佳成熟時(shí)間，同時(shí)分析VC促進(jìn)DC成熟的原因。結(jié)果: VC可顯著刺激DC細(xì)胞成熟，其CD80/86表達(dá)較未添加VC組有明顯提升。且本研究顯示VC刺激DC的最佳濃度為1 mmol/L，當(dāng)DC培養(yǎng)至第三天時(shí)，VC組CD80/86表達(dá)率為(78.6±4.6) %，而空白對(duì)照組V0僅為(34.1±5.7) %; DC表面HLA-DR表達(dá): VC(56.8±4.4) %，空白對(duì)照組V0為(25.4±4.7) %，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;進(jìn)而我們考察了VC對(duì)DC細(xì)胞CD40、CD40L表達(dá)情況，結(jié)果顯示，VC 2.5 mmol/L組CD40表達(dá)率最高可達(dá)(59.3±3.7) %，V0組僅為(11.1±2.4) %，說明VC可顯著調(diào)節(jié)DC表面CD40的表達(dá)。而CD40L表達(dá)調(diào)節(jié)并未體現(xiàn)。熒光顯微鏡結(jié)果顯示VC-DC抗原捕獲能力顯著提升。結(jié)論: VC可顯著調(diào)控DC成熟，并可能通過上調(diào)CD40進(jìn)而促進(jìn)CD80/86及HLA-DR的表達(dá)，當(dāng)VC濃度為1 mmol/L時(shí)，對(duì)DC調(diào)控作用最強(qiáng)。

［關(guān)鍵詞］維生素C;樹突狀細(xì)胞;表面共刺激分子; CD40

①本文受山西省生物治療示范平臺(tái)項(xiàng)目資助(No.2014091105-0101)。

Regulation impact of vitamin C in DC function

JIA Yuan，LI Wen-Li，LI Fang，ZHAO Qing，ZHANG Jun-Ping.Department of Medical Oncology(Cancer Bio-Therapy)，Shanxi Academy of Medical Sciences，Taiyuan 030032，China

［Abstract］Objective: To study the influence of vitamin C (VC) on dendritic cells (DC)，and detect DC maturation，to provide a feasible method and thought for quickly preparating DC vaccines.Methods: Collected the peripheral blood (about 50 ml) from healthy volunteers，and isolated peripheral blood mononuclear cells with lymphocyte separation medium and obtain DC.With stimulating with different concentrations of VC for (24 h)，then washed with PBS，and set up blank control group (V0) .The expression of DC surface costimulating molecules CD80/86 and HLA-DR，CD40 was detected by flow cytometry.By setting the concentration gradient and time gradient，exciting optimal concentration and stimulating time of VC on DC，and analyzed the reasons of VC promoting DC maturation.Results: VC could effectively stimulate DC，CD80/86 expression had significantly increased contrast to the blank control group(V0) .And the experiments show that VC’s best stimulating concentration was 1 mmol/L，and on the third day，the CD80/86 expression rate of VC group was (78.6±4.6) %，and blank control group V0 was (34.1±5.7) %.DC surface HLA-DR expression: VC (56.8±4.4) %，blank control group V0 (25.4±4.7) %，the difference between two groups was statistically significant，P＜0.05.CD40 and CD40L expression and results show that VC 2.5 mmol/L group of CD40 expression rate up to (59.3±3.7) %，while V0 group was only (11.1±2.4) %，that illustrate VC could significantly regulate CD40 expression on DC surface，but CD40L not reflect.Fluorescence microscope results showed that DC’s antigen catching ability was also significantly promoted.Conclusion: VC can significantly regulate DC maturity，and may up regulate CD40，thus promoting the express of CD80/86 and HLA-DR.When the concentration is 1 mmol/L，VC expresses the strongest regulation function on DC.

［Key words］Vitamin C; Dendritic cell (DC) ; Co-stimulating molecular; CD40

維生素C是人體所必需的一類小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它可確保機(jī)體功能正常發(fā)揮及免疫功能穩(wěn)定。研究顯示［1］，高濃度的維生素C富集于多種免疫細(xì)胞中，包括:嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等，扮演“抗氧化劑”作用以對(duì)抗機(jī)體氧自由基［2］，且因感染及炎癥而快速消耗，表明VC可能是維持自發(fā)免疫及獲得性免疫穩(wěn)定的一個(gè)重要因素。另外，VC還可提升淋巴細(xì)胞的增殖能力及NK細(xì)胞的自然殺傷活性［3，4］。而May等［5］另一項(xiàng)研究顯示，VC也可增加嗜中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞抗菌活性，但對(duì)于T淋巴細(xì)胞數(shù)量卻未見影響。Noh［6］另?yè)?jù)報(bào)道顯示，遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)發(fā)生會(huì)因VC含量缺乏而減弱，而對(duì)VC進(jìn)行補(bǔ)充后，DTH反應(yīng)又會(huì)恢復(fù)至正常水平。

另有細(xì)胞免疫研究顯示，對(duì)于Gulo(-/-)基因缺陷型小鼠(L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶基因缺陷型小鼠，突變可能導(dǎo)致部分動(dòng)物無(wú)法合成Vc)［7］，VC可促進(jìn)免疫反應(yīng)向Th1細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)IFN-γ、TNF-α的產(chǎn)生，當(dāng)VC缺乏時(shí)可能導(dǎo)致小鼠炎癥的發(fā)生。而隨著VC的持續(xù)補(bǔ)充，Th1型免疫反應(yīng)顯著提升，同時(shí)小鼠體內(nèi)IgG1、IgE以及Th2型免疫細(xì)胞抗體明顯下降，而一種Th1型免疫相關(guān)抗體IgG2C含量也會(huì)顯著提高，并且會(huì)提升DTH反應(yīng)強(qiáng)度［7，8］，表明VC會(huì)顯著影響CD4+細(xì)胞亞群分化。另?yè)?jù)Hwang［4］報(bào)道，VC還可促進(jìn)外周血CD8+記憶性T細(xì)胞增殖［4］。但VC如何對(duì)免疫進(jìn)行調(diào)控，其機(jī)制目前尚不明了。

樹突狀細(xì)胞(DC)是功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(APC)。當(dāng)免疫共刺激分子，如CD80、CD86等在DC細(xì)胞表面高表達(dá)時(shí)，DC細(xì)胞可快速提呈抗原信息，發(fā)揮免疫功能，刺激T淋巴細(xì)胞成熟［9，10］。同時(shí)，DC的成熟與分化還與細(xì)胞天然免疫Toll樣受體(TLR)密切相關(guān)。研究報(bào)道，作為氧化劑的H2O2可顯著刺激DC細(xì)胞成熟、分化，并上調(diào)CD4+免疫反應(yīng)［11，12］。那么作為抗氧化劑的VC(抗壞血酸)對(duì)DC細(xì)胞成熟與分化是否有影響? VC如何調(diào)控DC細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)控作用?其細(xì)胞表面共刺激分子如何表達(dá)?本文將就此展開研究。

1　材料與方法

1.1試劑耗材維生素C(VC)購(gòu)自Sigma，rhGMCSF、rhIL-4、rhTNF-α(Peprotech公司)，10%胎牛血清(杭州四季青)，RPMI1640(Scientific公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD86mAb，PE標(biāo)記CD80mAb，APC標(biāo)記MHCⅡDR，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD40mAb，PE標(biāo)記CD40L(CD154) mAb，F(xiàn)icoll分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)。

1.2儀器設(shè)備倒置顯微鏡(奧林巴斯)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘智)，臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppondorf)，流式細(xì)胞儀(BD公司)，生物安全柜(新加坡ESCO)。

1.3主要方法

1.3.1細(xì)胞分離采集健康志愿者外周血與PBS按照1∶4混合均勻，將稀釋后的血液以1∶1比例緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上方，4℃2 000 r/min離心15 min。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，加入另一離心管中，并用4倍體積PBS洗滌1 000 r/min離心5 min，離心去除淋巴細(xì)胞分離液。PBS洗滌兩次后，即獲得外周血單核細(xì)胞。

1.3.2 DC細(xì)胞培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞懸浮于1640培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為108ml－1，于48孔細(xì)胞培養(yǎng)板上貼壁。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)3～6 h后，收集懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞PBS蕩洗兩次后為DC前體細(xì)胞，于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，加入1640培養(yǎng)基: GM-CSF(800 U/ml)和IL-4(1 000 U/ml)，細(xì)胞濃度約為106ml－1并繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3實(shí)驗(yàn)組設(shè)置于48孔板細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度VC，濃度梯度為0 μmol/L、100 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L，1 mmol/L、2.5 mmol/L。貼壁的DC前體細(xì)胞洗滌后，加入上述濃度VC(RPMI1640，10%FBS，GM-CSF 800 U/ml和IL-4 1 000 U/ml)孵育24 h，洗滌，之后培養(yǎng)液RPMI1640，10%FBS，GM-CSF 800 U/ml和IL-4 1 000 U/ml培養(yǎng)。

1.3.4 CD80、CD86、CD40、CD40L (CD154)以及HLA-DR表達(dá)分析DC細(xì)胞經(jīng)吹洗后懸浮，用FITCCD86mAb、PE-CD80mAb、APC-HLA-DR、FITCCD40mAb、PE-CD40L(CD154) mAb標(biāo)記DC 30 min之后上流式細(xì)胞檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3.5熒光倒置顯微鏡觀察VC-DC抗原捕獲能力

NY-ESO-1是目前證實(shí)最具免疫原性的腫瘤-睪丸抗原(CT-Antigen)之一，其155～167位點(diǎn)是其發(fā)揮免疫原性的核心抗原決定簇。本項(xiàng)目組將NY-ESO-1155-167與熒光素FITC共價(jià)合成，與VC-DC孵育2 h后洗滌(10 ng/ml)，并在熒光顯微鏡下觀察。通過熒光灰度檢測(cè)，對(duì)比未加VC培養(yǎng)的DC細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS21系統(tǒng)分析軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均以x ±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用配對(duì)的t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)的比較采用方差分析，方差不齊用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1形態(tài)學(xué)觀察較之未添加VC實(shí)驗(yàn)組，DC培養(yǎng)過程中加入VC可顯著提升DC的成熟速度及分化程度。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，DC表現(xiàn)為細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，體積變大，樹突狀分化顯著(第三天) (如圖1A～D)，同時(shí)呈現(xiàn)出對(duì)VC的濃度依賴性。2.2 VC可上調(diào)DC表面CD80、CD86表達(dá)氧化還原(Redox)調(diào)節(jié)反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)一種普遍的調(diào)節(jié)方式。研究顯示，在H2O2存在情況下，可刺激DC細(xì)胞表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)［11］。而在本研究中，我們對(duì)比了不加VC(空白對(duì)照)及不同濃度VC下DC細(xì)胞表面二類共刺激分子標(biāo)志CD80、CD86表達(dá)情況影響。結(jié)果顯示，VC可顯著促進(jìn)DC表面二類分子CD80、CD86表達(dá)(圖2A、B)，并呈現(xiàn)濃度依賴正相關(guān)性。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)還顯示，VC對(duì)DC細(xì)胞CD80/86調(diào)節(jié)最佳濃度約為1 mmol/L，作用時(shí)間約為3 d，成熟度CD80/86可達(dá)(78.6±4.6) %(圖2C)。

2.3 VC可刺激APC細(xì)胞表面MHCⅡ分子DR表達(dá)

在機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)中，細(xì)胞免疫發(fā)揮主要的效應(yīng)。CD8+的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)是有效抗腫瘤細(xì)胞免疫的核心［4］，而這與DC息息相關(guān)。未成熟的DC能通過內(nèi)吞作用高效的捕捉抗原，胞內(nèi)加工處理后與MHCⅠ、MHCⅡ形成復(fù)合體，再提呈于DC表面，為激活抗原特異性的T淋巴細(xì)胞提供必需的第一信號(hào)［8-10］。因此我們考察了VC對(duì)DC細(xì)胞表面MHCⅡ類分子DR表達(dá)影響。結(jié)果顯示，VC可顯著刺激MHCⅡ分子DR表達(dá)(P＜0.05) (圖3A、B)，并呈現(xiàn)VC濃度依賴性及作用時(shí)間依賴性，當(dāng)VC濃度達(dá)到1 mmol/L(處理24 h)，培養(yǎng)3 d后DC表達(dá)MHCⅡDR達(dá)到(56.8±4.4) %(圖3B、C)。

2.3 VC可上調(diào)DC表面CD40表達(dá)進(jìn)而我們做了CD40及CD154表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖4)，DC細(xì)胞表面CD40表達(dá)隨著VC作用濃度增加而呈現(xiàn)梯度依賴性，而CD154并沒有顯示此特性(P＜0.05)，說明VC促進(jìn)DC細(xì)胞成熟可能通過上調(diào)CD40表達(dá)進(jìn)而刺激B7-1(CD80)、B7-2(CD86)及MHCⅡDR表達(dá)。

2.4 VC-DC抗原捕獲能力顯著提升將1 mmol/ L VC培養(yǎng)3 d的DC與未加VC培養(yǎng)的DC抗原捕獲能力相比較，利用FITC標(biāo)記的NY-ESO-1155-167與DC細(xì)胞共孵育2 h，洗滌兩次后經(jīng)熒光倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)VC-DC其熒光強(qiáng)度顯著高于未經(jīng)VC刺激的DC(圖5A～D) (細(xì)胞濃度106ml－1)。通過熒光灰度檢測(cè)顯示，VC-DC捕獲抗原能力顯著高于未經(jīng)刺激的DC(圖5E)，說明VC不僅可促進(jìn)DC細(xì)胞成熟，同時(shí)也可促進(jìn)DC細(xì)胞的抗原捕獲及提呈能力。

圖1　 DC細(xì)胞形態(tài)觀察(×200)Fig．1 DC cell morphological observation(×200)

圖2　 VC對(duì)DC細(xì)胞共刺激分子CD80/86調(diào)控影響Fig．2 Regulation effect of VC to stimulation molecules CD80/86 on DC

圖3　 VC對(duì)DC細(xì)胞表面HLA-DR調(diào)控影響Fig．3 Regulation effect of VC to HLA-DR on DC

圖4　 VC對(duì)DC表面CD40調(diào)控影響Fig．4 Regulation effect of VC to CD40 on DC

3　討論

Note: A.DC cells on microscope; B.DC cells on fluorescence microscope with no peptides; C.The antigen capturing ability of VC-DC to FITC-peptide; D.The antigen capturing ability of DC with none VC to FITC-peptides; E.The detection of Fluoresent gray level on DC of Fig.C and D.VC= 1 mmol/L，peptides= 10 ng/ml，2 h.

維生素C是一種有效防止氧化損傷的抗氧化劑，可清除細(xì)胞內(nèi)氧化自由基(O2－)［4］。生理范圍下，維生素C在血清中含量一般在70～100 μmol/L。研究顯示，靜脈注射3 g維生素C，其受注者血清中VC的含量可達(dá)到1 700 μmol/L，但是如果患者口服相同劑量，血液中VC含量?jī)H達(dá)220 μmol/L［6］。本實(shí)驗(yàn)證明在高濃度VC(2.5 mmol/L)影響下DC細(xì)胞依然可保持生理活性，較之生理濃度要顯著高出很多，因此我們認(rèn)為高劑量的VC(如文中1 mmol/ L)對(duì)于聯(lián)合放化療治療癌癥是一種途徑。

據(jù)研究顯示VC可作為一種抗腫瘤前體物質(zhì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制生長(zhǎng)，大劑量的VC(約5 mmol/L)可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，當(dāng)黑色素瘤細(xì)胞B16F10暴露在VC中時(shí)［13，14］，VC可引起細(xì)胞色素C釋放進(jìn)而引起線粒體酶減少。又有研究顯示，VC可通過下調(diào)CD71(轉(zhuǎn)鐵蛋白)的表達(dá)進(jìn)而降低細(xì)胞對(duì)金屬離子(鐵離子)的攝入，后者被認(rèn)為是維持腫瘤細(xì)胞活性的必要因素之一［15］;而低劑量的VC(小于1 mmol/L)，又可通過調(diào)節(jié)Chk2-p53-p21Waf1/ Cip1途徑以及影響細(xì)胞膜上受體生長(zhǎng)因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF) -1等來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖［16］。且對(duì)于VC的抗腫瘤機(jī)制又有了新的發(fā)現(xiàn)，VC可以通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)而抑制腫瘤血管生成［16］。而另?yè)?jù)Chen等［17］研究認(rèn)為VC抗腫瘤機(jī)制可能是VC會(huì)釋放游離過氧化氫，直接作用于腫瘤細(xì)胞DNA干擾腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但VC作為免疫調(diào)控物質(zhì)的研究卻鮮有報(bào)道。

CD80、CD86是DC細(xì)胞表面共刺激分子，作為重要的第二信使可刺激T淋巴細(xì)胞發(fā)揮功能，因此CD80、CD86的上調(diào)意味著DC功能的成熟［12］。研究顯示CD80、CD86受CD40-CD40L調(diào)控，并成正相關(guān)［9］。本文證明VC可有效調(diào)控DC細(xì)胞成熟，當(dāng)濃度為1 mmol/L時(shí)，對(duì)DC表面共刺激分子CD80、CD86，MHCⅡDR及CD40表達(dá)有顯著上調(diào)作用，很可能VC通過上調(diào)CD40的表達(dá)進(jìn)而刺激CD80、CD86及MHCⅡ表達(dá)，以增強(qiáng)DC抗原捕捉、提呈等功能。同時(shí)本研究證明VC處理最佳濃度為1 mmol/L時(shí)，DC最佳培養(yǎng)時(shí)間為3 d，較之傳統(tǒng)DC培養(yǎng)方法7 d顯著縮短時(shí)間，可用于快速制備DC疫苗。

而另一方面，H2O2等氧化劑可顯著上調(diào)DC細(xì)胞的分化程度，那么作為抗氧化劑的VC為何也能上調(diào)DC分化及活性?就VC而言，存在兩種形式，還原態(tài)(抗壞血酸)及氧化態(tài)(脫氫抗壞血酸，DHA)，并且能在二者之間快速循環(huán)，這個(gè)過程中可能產(chǎn)生大量的游離O2－自由基，進(jìn)而上調(diào)DC活性。但對(duì)于VC調(diào)控DC細(xì)胞的分子機(jī)制以及VC的免疫反應(yīng)，特別是對(duì)T淋巴細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步詳細(xì)的研究。

參考文獻(xiàn):

［2］Hartel C，Puzik A，Schultz C，et al．Immunomodulatory effect of vita min C on intracytoplasmic cytokine production in neonatal cord blood cell［J］．Neonatology，2007，91(11) : 54-60.

［3］Bergsten PG，Amitai M，Levine，et al．Millimolar concentrations of ascorbic acid in purified human mononuclear leukocytes.Depletion and reaccumulation［J］．Biol Chem，1990，265(3) : 2584-2587.

［4］Young-Joo Jeong，Jin-Hee Kim，Young-il Hwang，et al．Vita min C treatment of mouse bone marrow-derived dendritic cells enhanced CD8+memory T cell production capacity of these cells in vivo［J］．Immunobiology，2014，219(7) : 554-564.

［5］May JM，Huang J，Qu ZC，et al．Macrophage uptake and recycling of ascorbic acid: response to activation by lipopolysaccharide［J］．Free Radic Biol Med，2005，39(11) : 1449-1459.

［6］Noh K，Lim H，Hwang YI，et al．Mega-dose Vita min C modulates T cell functions in Balb/c mice only when ad ministered during T cell activation［J］．Immunol Lett，2005，98(10) : 63-72.

［7］Kim H，Bae S，Lee WJ，et al．The analysis of vita min C concentration in organs of gulo(-/-) mice upon vita min C withdrawal［J］．Immune Netw，2012，12(10) : 18-26.

［8］Singh UP，Parthasarathy，Mohan G.In-vitro antioxidant and antihyperlipidemic activities of Blumea eriantha DC［J］．Pak J Pharm Sci，2014，27(6) : 1961-1965.

［9］Ma DY，Clark EA.The role of CD40 and CD40L in dendritic cells ［J］．Semin Immunol，2009，21(5) : 265-272.

［10］Banchereau J，Briere F，Palucka K，et al．Immunobiology of dendritic cells［J］．Annu Rev Immunol，2000，18(8) 18: 767-811.

［11］Olivier Preynat-Seauve，Sylvia Coudurier，Christian Villiers，et al．Oxidative stress impairs intracellular events involved in antigen processing and resentation to T cells［J］．Cell Stress and Chaperones，2003，8(2) : 162-171.

［12］Thorén FB，Betten A，Romero AI，et al．Antioxidative properties of myeloid dendritic cells: protection of T cells and NK cells from oxygen radical-induced inactivation and apoptosis［J］．Immunology，2007，12(179) : 179: 21-25.

［13］Levine MY，Wang J，Morrow，et al．A new recommended dietary allowance of vita min C for healthy young women［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(5) : 9842-9846.

［14］Cho D，Hahm E，Lee WJ，et al．Vitamin C downregulates interleukin-18 production by increasing reactive oxygen intermediate and mitogen-activated protein kinase signalling in B16F10 murine melanoma cells［J］．Melanoma Res，2003，13(41) : 549-554.

［15］Padayatty SJ，Sun HY，Wang SM，et al．Vitamin C pharmacokinetics: implications for oral and intravenous use［J］．Ann Intern Med，2004，140(15) : 533-537.

［16］Kang JS，Cho D，Hwang WJ，et al．Sodium ascorbate (vitamin C) induces apoptosis in melanoma cells via the down-regulation of transferring receptor dependent iron uptake［J］．Cell Physiol，2005，204(11) : 192-197.

［17］Chen Q，Espey MG，Sun AY，et al．Aseorbate in pharmacologic concentrations selectively generates aseorbate radical and hydrogen peroxide in extracellular fluid in vivo［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(21) : 8749-8754.

［收稿2015-04-20修回2015-06-24］

(編輯倪鵬)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．006

作者簡(jiǎn)介:賈原(1983年－)，男，技師，主要從事腫瘤免疫治療方面研究，E-mail: john83629@ sina．com。

通訊作者②，E-mail: junpingzhang_118@163．com。

文章編號(hào)1000-484X(2015) 10-1324-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

中圖分類號(hào)R392-3