虞靜芳

（蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215200）

定量熒光PCR在肺炎支原體肺炎診斷中的應(yīng)用

虞靜芳

（蘇州市吳江區(qū)第一人民醫(yī)院，江蘇 蘇州 215200）

目的研究定量熒光PCR在支原體肺炎診斷中的價值。方法選取2012年1月至2012年12月938例肺炎住院患兒，進(jìn)行定量熒光PCR、支原體抗體等多檢查，明確MP感染。結(jié)果412（36.2%）例診斷為MP肺炎，278例患兒PCR陽性，高M(jìn)P拷貝數(shù)的比例隨著患兒的年齡增大而增大（P＜0.01），高M(jìn)P拷貝數(shù)組的患兒發(fā)熱率高于低MP拷貝數(shù)組（P＜0.01）；高M(jìn)P拷貝數(shù)組的患兒喘息發(fā)生率高于低MP拷貝數(shù)組（P＜0.01）。高M(jìn)P拷貝數(shù)組患兒血清學(xué)陽性率明顯高于低MP拷貝數(shù)組（P＜0.01）。低MP拷貝數(shù)組的患兒混合感染率明顯高于高M(jìn)P拷貝數(shù)組（P＜0.01）。結(jié)論熒光定量PCR在MP肺炎的診斷中起重要的作用，高M(jìn)P拷貝數(shù)更能提示MP的致病作用，而低MP拷貝數(shù)的臨床意義可能不大。

定量熒光PCR；支原體肺炎

肺炎支原體（MP）是小兒時期感染性肺炎的重要病原之一[1]。臨床常運用血清學(xué)檢查MP抗體的方法診斷MP肺炎，然而該方法需間隔1～2周的雙份血清MP-IgM測定[2]，一般用于回顧性研究。近年來，PCR被廣泛用于MP感染的早期診斷，尤其對于嬰幼兒或免疫力低下的患兒，PCR有更好的臨床價值[3]。然而痰MP-PCR能出現(xiàn)假陽性，有研究發(fā)現(xiàn)支原體感染后患者痰PCR陽性最長可持續(xù)7個月，因此臨床上區(qū)分支原體現(xiàn)癥感染還是支原體攜帶存在困難。本研究使用定量熒光PCR探討不同滴度PCR在MP肺炎診斷中的應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 對象：選取于2012年1月至2012年12月間因急性呼吸道感染而住我院兒科治療的患兒938例，進(jìn)行多種病原學(xué)檢查，明確MP感染。

1.2 定量熒光PCR和病毒檢測：所有患兒均于入院24 h內(nèi)采集痰標(biāo)本，用一次性吸痰管送入患兒鼻腔5～10 cm，利用負(fù)壓吸取痰液1～2 mL，痰液標(biāo)本經(jīng)震蕩、離心、去上清，加入裂解液提取DNA，再進(jìn)行PCR擴增。此外，所有痰標(biāo)本應(yīng)用直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒-1、2、3和腺病毒抗原。

1.3 MP特異性抗體檢測：本研究MP血清學(xué)抗體顆粒凝集法采用日本富士瑞必歐株式會社生產(chǎn)的賽樂迪亞一麥克Ⅱ試劑盒。本實驗首份血清滴度≥1∶160為陽性；雙份血清以MP 抗體滴度4倍及以上升高為確診MP感染。

1.4 MP肺炎的診斷：因肺炎住院的患兒定量熒光PCR陽性或首份血清滴度≥1∶160為陽性或雙份血清以MP抗體滴度4倍及以上升高均診斷為MP肺炎。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組陽性率比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。計量資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MP定量PCR總檢出情況

2.1.1 在938例因呼吸道感染而住院的患兒中，412（36.2%）例診斷為MP肺炎，其中98（8.6%）例為單純PCR陽性診斷患兒，134（11.8%）例為單純血清學(xué)診斷患兒，180（15.8%）例PCR及血清學(xué)均陽性。在這412例MP肺炎患兒中，214（51.9%）例男性，198（48.1%）例女性，平均年齡為37個月（極差，1～145個月）。

2.1.2 在412例MP肺炎患兒中，278（67.5%）例患兒PCR陽性，PCR檢測范圍為＜2500拷貝/毫升至＞2.5×107拷貝/毫升，我們將PCR拷貝數(shù)分為兩組：高M(jìn)P拷貝數(shù)組（＞10拷貝/毫升）（n=141）和低MP拷貝數(shù)組（＜106拷貝/毫升）（n=137）。高M(jìn)P拷貝數(shù)的比例隨著患兒的年齡增大而增大（P＜0.01）。

2.2 MP定量PCR月檢出率分布情況：MP定量PCR陽性率在夏季（6～8月）達(dá)到高峰，且高M(jìn)P拷貝數(shù)的檢出率也在夏季檢出率最高，1～3月高M(jìn)P拷貝數(shù)人數(shù)為7例（13.5%），4～6月為32例（25.2%），7～9月為76例（49.6%），10～12月為26例（31.2%）。而低MP拷貝數(shù)組則無明顯四季差異性。

2.3 不同拷貝數(shù)MP定量PCR的臨床特點比較：MP定量PCR不同拷貝數(shù)的臨床特點見表1。高M(jìn)P拷貝數(shù)組的患兒年齡大于低MP拷貝數(shù)組[51±52）個月vs （26±29）個月，P＜0.01]；高M(jìn)P拷貝數(shù)組的患兒發(fā)熱率高于低MP拷貝數(shù)組（78.7% vs 58.7%，P＜0.01）；高M(jìn)P拷貝數(shù)組的患兒喘息發(fā)生率高于低MP拷貝數(shù)組（15.8% vs 35.8%，P＜0.01）。

2.4 不同拷貝數(shù)MP定量PCR的血清學(xué)抗體比較：在這278例PCR陽性的MP肺炎患兒中，147例入院時血清學(xué)檢測陽性，其中高M(jìn)P拷貝數(shù)組有98例，低MP拷貝數(shù)組有49例，高M(jìn)P拷貝數(shù)組患兒血清學(xué)陽性率明顯高于低MP拷貝數(shù)組（P＜0.01）。入院時，高M(jìn)P拷貝數(shù)組患兒血清學(xué)抗體幾何平均滴度隨年齡的增加呈遞增趨勢，而低MP拷貝數(shù)組隨著年齡的增大變化不大。

2.5 不同拷貝數(shù)MP定量PCR的混合感染比較：在這278例PCR陽性的MP肺炎患兒中，176（63.3%）例患兒存在混合感染，即存在MP以外的其他病原學(xué)依據(jù)，98例合并病毒感染，78例合并細(xì)菌感染。低MP拷貝數(shù)組的患兒混合感染率明顯高于高M(jìn)P拷貝數(shù)組（28.1% vs 8.9%，P＜0.01）。

3 討 論

MP感染主要引起呼吸系統(tǒng)疾病。MP經(jīng)飛沫傳染，潛伏期以及病程長，臨床癥狀消失后仍可持續(xù)帶病原體數(shù)月。MP首次感染后可存在于呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)長達(dá)數(shù)月之久，可發(fā)展為無癥狀攜帶者[4]。

目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的檢測方法是血清特異性抗體的檢測，如顆粒凝集法，酶聯(lián)免疫法等。由于MP-IgM于感染后7～10 d產(chǎn)生，因此在病程早期（如1周內(nèi)）檢測MP特異性抗體常會出現(xiàn)假陰性。而雙份血清學(xué)檢測雖能避免假陰性結(jié)果，但由于第2份血清采集時間長在第1次后的1～2周后，臨床上廣泛應(yīng)用并不實際。此外，對于免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟及存在免疫缺陷的患兒MP-IgM的檢測同樣存在一定的局限性[5]。

表1 支原體定量PCR不同拷貝數(shù)的臨床特點比較.

近年來隨診檢驗水平的提高，熒光PCR的應(yīng)用，使臨床醫(yī)師能在早期診斷MP肺炎。我們的研究發(fā)現(xiàn)年齡越大，其感染MP時拷貝數(shù)越高，而在嬰幼兒MP拷貝數(shù)則較低，拷貝數(shù)越高，越提示支原體感染，這與MP在學(xué)齡前期兒童及學(xué)齡期兒童的致病力較強一致。

在此次研究的278例PCR陽性的MP肺炎患兒中，147（52.9%）例血清學(xué)檢測陽性。而在這147例血清學(xué)檢測陽性的患兒中，多數(shù)患兒PCR為高M(jìn)P拷貝數(shù)（98/147）；且在不同年齡段，高M(jìn)P拷貝數(shù)患兒隨著年齡的增長呈增長趨勢。此外高M(jìn)P拷貝數(shù)組的患兒混合感染率明顯低于低MP拷貝數(shù)患兒（8.9%），說明高M(jìn)P拷貝數(shù)提示MP在此次肺炎中的致病作用，而低MP拷貝數(shù)患兒血清學(xué)檢測陰性率高，且常存在混合感染，提示低MP拷貝數(shù)可能在此次肺炎中的臨床意義不大，應(yīng)警惕MP污染或攜帶。

綜上所述，熒光定量PCR在MP肺炎的診斷中起重要的作用，高M(jìn)P拷貝數(shù)更能提示MP的致病作用，而低MP拷貝數(shù)的臨床意義可能不大。

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