佘　飛，蘇　琴，張　憲，孫本強,賈曉穎,趙曉東，張　華

·論著·

小鼠脊髓損傷組織高表達的microRNA-21對neuro-2a細胞PDCD4的影響

佘飛，蘇琴，張憲，孫本強,賈曉穎,趙曉東，張華

【摘要】目的驗證小鼠損傷脊髓中高表達的microRNA-21(miR-21)在neuro-2a細胞中對程序性細胞死亡因子4(PDCD4)的作用，初步探討miR-21在脊髓損傷過程中的作用。方法將neuro-2a細胞在體外培養(yǎng)16h，分別按相應體系轉染miR-21 mimics，繼續(xù)培養(yǎng)48h，提取6孔板內細胞總蛋白和總RNA行蛋白印記和實時定量PCR檢測，利用HEK293細胞行熒光素酶報告基因檢測。結果neuro-2a細胞轉染miR-21 mimics后，其內源性程序性細胞死亡因子4(PDCD4)的表達在蛋白和mRNA水平均明顯降低。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,miR-21對PDCD4 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)的預測位點有直接抑制作用，而將此位點突變后，miR-21對PDCD4 3′-UTR預測位點的抑制作用消失。結論miR-21通過直接作用于PDCD4 3′-UTR靶位點從而在mRNA和蛋白水平抑制PDCD4的表達。miR-21可能在脊髓損傷過程中具有重要的保護作用。

【關鍵詞】脊髓損傷；神經；細胞；蛋白；小鼠

作者單位：100048北京，首都地區(qū)軍隊急救中心 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院急救部(佘飛，蘇琴，張憲，趙曉東)；300381天津，解放軍第四六四醫(yī)院(孫本強，賈曉穎);100820北京，二炮禮士路門診部(張華)

microRNA(miRNA)是一類大小約22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過與靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)互補配對，導致靶基因mRNA降解和(或)翻譯受阻，在轉錄后水平調控基因的表達[1]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類miRNA 1100余種，其中與脊髓損傷相關的miRNA的報道尚不豐富。前期研究發(fā)現(xiàn)小鼠脊髓損傷組織中microRNA-21(miR-21)的表達水平與正常脊髓組織相比顯著升高[2]，生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)其預測靶基因包括程序性細胞死亡因子4(PDCD4)。PDCD4是一類細胞凋亡相關基因，降低其表達可以抑制細胞凋亡的發(fā)生，對細胞起保護效應[3-5]。為明確miR-21在神經細胞中對PDCD4的調控作用，本實驗先后采用western blotting和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)對neuro-2a中可能受到miR-21調控的靶基因PDCD4的蛋白和RNA表達水平進行了驗證分析，并利用熒光素酶報告基因分子生物學篩靶技術分析miR-21作用于PDCD4的機制，從抑制凋亡相關基因的角度探討miR-21在脊髓損傷過程中對神經細胞可能的作用。

材料與方法

1細菌、細胞和質粒

自ATCC公司(美國)購買neuro-2a細胞和HEK293細胞，進行傳代培養(yǎng)。自北京天根生物公司購買感受態(tài)大腸桿菌TOP10。將購自Promega 公司(美國)的pGL3質粒插入酶切位點從而構建熒光素酶報告基因pGL-3M質粒。

2主要試劑和材料

2.1主要試劑自Invitrogen公司(美國)購買改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Lipofectamine TM2000轉染試劑和細胞RNA提取劑Trizol；自Hyclone公司(美國)購買胎牛血清；自Promega公司購買反轉錄酶試劑盒ImProm-IITM、質粒抽提試劑盒及雙熒光素酶報告基因試劑盒；自TaKaRa公司(日本)購買dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)、RNA 酶抑制劑、SYBR Premix Ex Taq定量PCR試劑和T4-DNA連接酶；自QIAGEN公司(德國)購買Quanti Tect SYBR Green PCR Kit；自NEB公司(上海)購買DNA限制性內切酶Nde I和Xba I；自北京天根生物公司購買基因組DNA提取試劑盒、Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和DNA回收試劑盒；自Abcam公司(英國)購買PDCD4抗體；自中山金橋生物公司購買辣根過氧化物酶標記的二抗；自北京康為世紀生物科技有限公司購買BCA蛋白定量試劑盒和eECL Western Blot Kit化學發(fā)光檢測試劑盒。

2.2材料miRNA mimics由上海吉瑪公司合成

Mimics正義鏈序列反義鏈序列陰性對照5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'miR-215'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'

2.3PDCD4和β-actin mRNA的引物由上海吉瑪公司合成

基因正向序列反向序列β-actin5'-CCACACCCGCCACCAGTTC-3'5'-CCTTCTGACCCATTCCCACCATC-3'PDCD45'-ATGCTGGCACTGAAGAAATA-3'5'-TTCCATTGTCACTGACTGAG-3'

2.4擴增PDCD4 3′-UTR片段和突變體的引物由上海吉瑪公司合成

基因正向序列反向序列PDCD4-3'UTR5'-TGCTCTAGAGCACAGCAACTCTTCA-3'5'-CGCCATATGCTAAAGAATCAACAGT-3'PDCD4-3'UTR突變體5'-CCGAAGTGTGGGTGTTCTGTAGTCG5'-AACATGGCACTTAGAAAGGTCGACTACAGAACCTTTCTAAGTGCCATGTT-3'ACACCCACACTTCGG-3'

3實驗方法

3.1neuro-2a胞轉染及western blotting檢測PDCD4蛋白的表達(1)將neuro-2a細胞按(3×105/孔)接種于6孔板內，利用含有10%血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃孵育16h。(2)取2個無核糖核酸酶(RNase)的EP管，分別加入250μL最低必需培養(yǎng)液(MEM)，向其中1管加入5 μL Lipofectamine TM 2000，剩下1管加入5μL 雙鏈miRNA(空白對照組除外)，將上述2管各自混勻后靜置5min，再將2管合為1管并混合，靜置20min。(3)棄除原培養(yǎng)基，向培養(yǎng)孔里均勻的滴加1.5mL無雙抗的培養(yǎng)基，將上述配置好的轉染液均勻滴加到各孔中，輕微混勻，48h后收集細胞。(4)提取蛋白質，棄除培養(yǎng)基，向培養(yǎng)孔內加入1mL預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，其后吸盡PBS加入100μL放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液在冰上充分裂解，將裂解產物收集到1.5mL的EP管中，在12000轉/min條件下離心10min，收集上清即得到細胞總蛋白。(5)利用二喹啉甲酸蛋白檢測(BCA)法檢測所提取蛋白質的濃度。(6)利用上述提取的蛋白質樣品行western blotting檢測。

3.2RNA的提取及實時定量PCR檢測PDCD4 mRNA的表達(1)細胞培養(yǎng)及轉染同前。(2)利用Trizol提取各培養(yǎng)孔中細胞總RNA，并將提取產物溶于20μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水。(3)檢測所提取RNA的OD值，D260/D280均在1.8~2.0。(4)逆轉錄：取RNA模板1μg，加入Oligo(dT)引物(濃度0.5μg/μL)1μL 和RT酶1μL 按以下反應條件進行逆轉錄：25 ℃ 5min，42 ℃ 1h，70 ℃ 15min。(5)實時定量PCR檢測：各取10μl SYBR Premix EX Taq、0.8μl混合引物、0.4μL Rox Reference Dye II(50×)、1μL DNA模板及7.8μL無菌水混勻按以下反應條件進行檢測：95 ℃ 15min，95 ℃ 10s，60 ℃ 30s，72 ℃ 30s，40個循環(huán)；最后95 ℃ 1min，55 ℃ 1min，95 ℃ 1min。以β-actin作為內參。

3.3構建包含PDCD4 3′-UTR野生型和突變型序列的報告基因質粒利用PCR擴增含小鼠基因組中PDCD4 3′-UTR的片段，通過所設計的引物在所擴增的片段兩端分別插入Xba I和Nde I酶切位點，其后行雙酶切，再插入pGL-3M載體質粒。對可能作用的靶位點，利用特異引物重疊PCR擴增的方法，得到含已發(fā)生突變的3′-UTR序列的片段，利用上述方法插入pGL-3M載體質粒。將所構建的重組質粒經行轉化，并通過鑒定和測序，最終從含構建成功的菌落中提取質粒。將重構質粒分別標作pGL-PDCD4 3′-UTR和pGL-PDCD4 3′-UTR-mut。

3.4雙熒光素酶報告基因體系檢測miR-21對PDCD4的調控機制(1)將HEK293細胞按5×104/孔接種于24孔板內，利用含有10%血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基在37℃孵育16h。(2)取1.5mL無RNase EP管并加入500μL MEM，再依次加入報告基因質粒、內參質粒和轉染試劑，混勻后靜置5min。取250μL上述混合液分至1.5mL EP管，分別加入1.5μL空白對照或miR-21mimics，混勻后靜置20min。(3)棄除原培養(yǎng)基，加入無雙抗的培養(yǎng)基(450μL/孔)，再加入50μL對應的混合轉染液，在37℃孵箱內培養(yǎng)12h后補液，24h后換液，48h后行雙熒光素酶報告基因檢測。(4)檢測熒光素酶活性：棄除培養(yǎng)基，用預冷的PBS液漂洗，吸盡PBS液后加入100μL細胞裂解緩沖液，置于搖床上充分裂解15min。取20μL上述細胞裂解液加入預先準備的含有40μL熒火蟲熒光素酶(firefly luciferase)試劑的EP管中，充分混勻，利用雙熒光素酶檢測儀檢測熒光值，記錄10s時的熒光值(即熒光素酶的表達量)；再混入40μl Stop&Glo試劑，記錄10s時的熒光值(即Renilla luciferase 的表達量)，同時利用pRL-CMV質粒活性進行校正，將前一數值與后一數值的百分比記錄為報告基因的相對表達量。最終結果為相對空白對照組的百分比值。

結果

1蛋白免疫印跡結果

通過預測軟件分析筆者發(fā)現(xiàn)PDCD4可能是miR-21的靶基因之一。為驗證在neuro-2a內miR-21能否調控PDCD4 的表達，本研究利用miR-21 mimics轉染neuro-2a，其后檢測PDCD4蛋白的表達量。western blotting結果顯示，miR-21 mimics轉染組neuro-2a細胞中PDCD4蛋白的表達水平顯著降低(圖1)。

圖1　neuro-2a細胞轉染miR-21 mimics 48h后利用Western-Blot檢測PDCD4蛋白的表達。選用Actin作為內參

2實時定量PCR結果

通過Western blotting檢測，筆者發(fā)現(xiàn)miR-21能夠抑制neuro-2a細胞PDCD4的蛋白表達。而通過實時定量檢測，筆者還發(fā)現(xiàn)miR-21 mimics轉染neuro-2a細胞后其內源性PDCD4 mRNA的表達量明顯減少，說明miR-21是通過抑制PDCD4的mRNA表達從而降低其蛋白表達(圖2)。

與空白對照組相比：*P<0.05

3雙熒光素酶報告基因檢測結果

為驗證miR-21是否直接作用于PDCD4 3′-UTR，筆者構建了報告載體pGL3-PDCD4 3′-UTR質粒和突變載體pGL3-PDCD4 3′-UTR-mut質粒(突變可能互補配對的位點的堿基)。然后將miR-21mimics分別與報告載體或突變體共轉染HEK293細胞。熒光素酶報告基因結果顯示，miR-21能顯著降低報告載體pGL3-PDCD4 3′-UTR報告基因熒光素酶的活性，而miR-21對pGL3-PDCD4 3′-UTRmut突變體報告基因的熒光素酶活性沒有明顯影響(圖3)。結果表明：miR-21可以與PDCD4 3′-UTR特異性結合，也提示miR-21可以直接作用于PDCD4的mRNA。

與陰性對照組相比：**P<0.01

討論

脊髓損傷后的病理生理學過程包括細胞凋亡和壞死、炎性反應、膠質細胞增生等，其具體調控機制目前尚不完全明確。miRNA是一類在動植物體內廣泛存在的短鏈非編RNA，其長度約為22個核苷酸。miRNA由DNA轉錄生成，但不能被翻譯生成蛋白質。miRNA能夠與靶基因mRNA特定區(qū)域的序列互補配對，使靶基因直接被降解和(或)抑制靶基因的蛋白翻譯，從而在轉錄后水平對蛋白質表達進行調控。目前，miRNA數據庫已收錄15172種miRNA，其中已發(fā)現(xiàn)人類的miRNA達1048種。隨著研究的深入，miRNA被證實具有重要的生物學功能，目前認為細胞增殖、凋亡、應激等重要生命過程都受到miRNA的調控[6-7]。因此，miRNA也很有可能在脊髓損傷過程中具有重要的調控作用，也完全有可能成為脊髓損傷后保護其再損傷的治療干預的新靶點。目前為止，對脊髓損傷后miRNA表達譜的變化及差異表達的miRNA的生物學作用研究尚不充分。前期研究發(fā)現(xiàn)在小鼠損傷的脊髓組織中存在miR-21的持續(xù)高表達，但其在脊髓損傷過程中的作用及其可能的作用機制并不明確。miRNA通過對其靶基因的調控從而發(fā)揮生物學效應。通過預測軟件分析，筆者發(fā)現(xiàn)PDCD4是miR-21可能的靶基因之一，另外在其它細胞系也已經證實miR-21能夠調控PDCD4的表達。理論上microRNA可能作用的靶基因能夠運用軟件進行預測，但其真正作用的靶基因尚需利用實驗學在特定細胞中進行驗證，因為microRNA在不同的細胞系中所作用的靶基因及生物學作用具有差異性。因此為驗證PDCD4是否在神經細胞中也是miR-21的靶基因，筆者在體外合成miR-21雙鏈通過轉染使其在neruo-2a細胞中高表達，結果發(fā)現(xiàn)PDCD4的表達無論在mRNA還是蛋白水平都明顯受抑制。同時筆者還構建了包含PDCD4 3′-UTR中可能與miR-21結合的位點的質粒。利用質粒熒光素酶報告基因體系，筆者發(fā)現(xiàn)miR-21能夠與PDCD4 3′-UTR相應的位點特異性結合，因而對PDCD4的調控是一種直接作用。 PDCD4是一類凋亡相關性基因，降低其表達可以抑制細胞凋亡的發(fā)生，對細胞起保護效應。本研究發(fā)現(xiàn)miR-21在神經細胞系neuro-2a中能夠抑制PDCD4這種重要的細胞凋亡相關基因的表達，而前期研究發(fā)現(xiàn)在多種損傷模型中miR-21正是通過抑制PDCD4的表達從而發(fā)揮保護效應[5,8-9]。因此筆者認為脊髓損傷后miR-21升高可能會抑制PDCD4的表達從而在脊髓損傷過程中具有保護作用。

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(本文編輯：黃小英)

Effect of high expressed microRNA-21 in rats with spinal tissue injury on the PDCD4 in neuro-2a cell

SHEFei1,SUQin1,ZHANGXian1,SUNBen-qiang2,JIAXiao-ying2,ZHAOXiao-dong1，ZHANGHua3

(1.Military Emergency Center of Capital Region,Department of Emergency，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of

Chinese PLA General Hospital,Beijing100048，China；2.The 464th Hospital of PLA,

Tianjin300381,China;3.South LiSi Road Clinics,General Hospital

of the Second Artillery of PLA,Beijing100820，China)

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of microRNA-21(miR-21)on its target gene PDCD4(programmed cell death 4) in neuro-2a cell and to explore its regulatory role in spinal injury.MethodsNeuro-2a cells were cultured for 16h and transfected with miR-21 mimics followed by further culture for 48h.Western blotting and qRT-PCR were performed to detect the expressions of PDCD4 protein and mRNA.Dual-luciferase reporter gene assay was employed to examine the repression of the PDCD4 gene.ResultsPDCD4 protein and mRNA expressions were significantly down-regulated in neuro-2a cell overexpressing miR-21.Dualluciferase reporter gene assay indicated that the predicted target site of PDCD4 3′-UTR was repressed directly by miR-21,but this repression did not occur at the mutant predicted target site of PDCD4 3′-UTR.ConclusionMiR-21 can directly repress the protein and mRNA expressions of PDCD4 by binding to a specific target site of PDCD4 3′-UTR.It may play an important protective role in spinal cord injury.

【Key words】spinal cord injury;neuron;cells;protein;rats

(收稿日期：2014-05-19；修回日期：2014-07-04)

通訊作者：趙曉東，E-mail:zxd63715@126.com

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃(973)項目(2005CB522602)

【中圖分類號】R 651.2

【文獻標識碼】A【DOI】10.3969/j.issn.1009-4237.2015.06.017

文章編號：1009-4237(2015)06-0546-04