陳峰 杜震生 曹惠萍 艾名洋 趙一強 宋維永518105廣東省深圳市松崗人民醫(yī)院

綜合康復對大鼠受壓坐骨神經微血管生成的影響

陳峰 杜震生 曹惠萍 艾名洋 趙一強 宋維永
518105廣東省深圳市松崗人民醫(yī)院

目的：探討康復訓練聯(lián)合針刺療法對大鼠卡壓坐骨神經微血管生成的影響。方法：造模成功的雄性SD大鼠40只，隨機分為4組。取大鼠卡壓神經中段標本石蠟切片進行CD34、血管內皮生長因子（VEGF）免疫組化染色，觀察神經微血管密度（MVD）及VEGF表達。結果：B、C、D組MVD及VEGF表達均高于A組（P＜0.05）。D組MVD及VEGF表達均高于B組和C組（P＜0.05）。結論：康復訓練及針刺療法對大鼠受卡壓坐骨神經微血管生成有促進作用，二者聯(lián)合運用，效果更優(yōu)。

康復訓練；針刺療法；坐骨神經；神經微血管生成；血管內皮細胞生長因子

周圍神經卡壓是手足外科常見、多發(fā)的損傷。精湛的顯微外科技術能精確地解除卡壓，然而，周圍神經受壓后，如何防止壓迫性神經傳導功能受損，恢復周圍神經的傳導功能，仍是當前研究的難點和熱點。穩(wěn)定的微循環(huán)可保證周圍神經的正常傳導功能，神經再生、功能恢復的關鍵是神經微血管的生成［1,2］。本實驗采用免疫組織化學方法觀察康復訓練聯(lián)合針刺療法對大鼠卡壓坐骨神經微血管生成的影響，探討其可能的意義。

資料與方法

主要試劑和動物分組：小鼠抗大鼠VEGF單抗、SABC免疫組化染色試劑盒、兔抗大鼠CD34多克隆抗體、SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均由武漢博士德生物技術有限公司提供。其他試劑均為國產AR級。選用雄性SD大鼠40只（廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供），體質量230～250 g。所有大鼠均在同一條件溫室飼養(yǎng)，光照12 h/d，自由進食、飲水。造模成功后的雄性SD大鼠40只簡單隨機化摸球法等分為4組：A組（對照組）：僅祛除卡壓；B組（康復訓練組）：祛除卡壓后行康復訓練；C組（針刺組）：祛除卡壓后行電針治療；D組（康復訓練+針刺組）：祛除卡壓后行康復訓練加電針治療。

大鼠坐骨神經卡壓模型的建立及各組處理：①動物模型制作：動物模型參照經典Mackinnon大鼠坐骨神經卡壓模型制作［3］。模型實驗動物于同一動物飼養(yǎng)室適宜環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周。實驗動物于術前8 h禁食水，常規(guī)麻醉、手術，制作坐骨神經卡壓模型。②康復訓練［4］：祛除卡壓術后第2周開始游泳訓練，1次/d，第1天10min，逐日增加3min，術后第3周開始每天游泳30min，直到術后第3周結束取材為止。③電針治療［5］：穴位電針刺激于祛除卡壓術后第2天開始，在特別的支架上固定，按實驗針灸學進行穴位定位，電針正極接在近心端，負極接在遠心端。分別夾在“足三里”和“環(huán)跳”穴處的針柄上。具體操作嚴格按文獻進行，直到術后第3周結束取材為止。

CD34免疫組化染色及MVD測定［6］：取卡壓神經中段標本石蠟切片，進行CD34免疫組化染色（具體步驟按照試劑盒說明書進行）。光學顯微鏡下觀察神經微血管密度（MVD）：CD34陽性染色微血管呈棕黃色至深棕色。參照Weidner微血管計數(shù)方法［7］，呈現(xiàn)棕色內皮細胞群或單個內皮細胞記為一個血管，選擇染色切片的血管密集區(qū)，在200倍視野下選5個再生神經視野，計數(shù)其中微血管量，求其平均值。

VEGF表達檢測：取卡壓神經中段標本石蠟切片，采用免疫組化染色（具體步驟按照試劑盒說明書進行）。利用德國Simple PCI圖像分析系統(tǒng)測量灰度，將免疫組化染色結果轉化為灰度值進行定量分析。陽性細胞著色部位為細胞膜或細胞漿，顏色為棕黃色。每張切片以組織間質空白處入射光的值為定標，每張切片選取5個視野（200倍），測定灰度值，取其平均值。

統(tǒng)計學方法：錄入SPSS 19.0軟件完成統(tǒng)計分析。所有數(shù)據均以（x±s）表示，兩組均數(shù)比較，采用t檢驗。以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。

結果

與A組比較，B、C、D組MVD含量均高于A組（P＜0.05）；與B、C組分別比較，D組MVD含量均高于B組和C組（P＜0.05）。大鼠坐骨神經微血管密度的測定，見表1、圖1。

與A組比較，B、C、D組VEGF表達均高于A組（P＜0.05）；與B、C組分別比較，D組VEGF表達均高于B組和C組（P＜0.05）。血管內皮細胞生長因子的表達，見表1、圖2。

討論

周圍神經卡壓是因為其特定部位受壓后導致其傳導功能受損的疾病，是手足外科常見疾病之一。神經卡壓導致其微循環(huán)改變，引起不同程度的感覺和運動功能障礙，其機制［8,9］：①周圍神經微循環(huán)障礙和機械性損傷導致其固有結構受損。②周圍神經的血液供應主要來自于其周圍的肌肉和筋膜，而周圍肌肉的萎縮和筋膜的受損導致卡壓神經缺血、缺氧。③周圍神經的血液供應是其再生的決定性因素，但卡壓神經出現(xiàn)的炎性反應增加了耗氧量，從而加重了卡壓神經的缺氧。④神經損傷后MVD下降，血管數(shù)量減少以及血管通透性的增加，都是導致卡壓神經缺血、缺氧的重要因素。Weerasriya通過實驗發(fā)現(xiàn)神經受損后其微循環(huán)中血管通透性達最高蜂的時間3 h［10］。Podhajsky發(fā)現(xiàn)損傷神經早期血管半徑和周長增加［11］，而血管數(shù)量減少，神經修復期血管數(shù)量和密度增加，而血管數(shù)量增加促進受損神經再生。

楊米雄等通過實驗發(fā)現(xiàn)主動運動可以明顯改善大鼠卡壓后坐骨神經的傳導功能和促進其再生［12-13］。張立寧等認為電針可促進受損神經再生［14］。但對康復訓練聯(lián)合針刺療法的綜合康復促進神經血管再生的實驗研究較少。

神經再生過程中其微循環(huán)中血管生成是主要的因素，而血管內皮生長因子（VEGF）又是血管生成的決定性因素［15］。 CD34是跨膜細胞表面糖蛋白，是毛細血管的內皮細胞標記物，故常用其標記新生血管［16-17］。

表1 大鼠坐骨神經MVD含量及VEGF表達的變化（x±s）

圖1 大鼠受壓坐骨神經各組CD34免疫組化染色（×200）

圖2 大鼠受壓坐骨神經VEGF在各組的表達（×200）

本研究采用康復訓練和針刺療法治療周圍神經卡壓，觀察該2種療法是否促進血管內皮細胞生長因子的表達，探討其對于神經微血管生成和功能恢復的影響，為臨床治療周圍神經損傷提供一些新的思路。在本實驗中，與A組比較，B、C、D組MVD含量及VEGF表達均高于A組（P＜0.05）；與B、C組分別比較，D組MVD含量及VEGF表達均高于B組和C組（P＜0.05）。說明康復訓練和針刺療法均能促進受損傷大鼠坐骨神經微血管生成，且二者聯(lián)合效果更明顯，從而證實了康復訓練聯(lián)合針刺療法的綜合康復能促進受卡壓大鼠坐骨神經再生修復，對神經功能的修復有積極的影響，為臨床從神經微循環(huán)角度治療神經損傷提供了理論依據。

［1］0u S,Zhao YD,Xiao Z,et al.Effect oil appaconitine on neuro pathiepain mediatedby P2X3 receptor in rat dorsal rootganglion［J］. Neurochem Int,2011,58（5）：564-573.

［2］劉俊建,王建廣,魏延云,等.同軸共紡復合神經生長因子導管修復大鼠坐骨神經缺損的實驗研究［J］.中華創(chuàng)傷骨科雜志,2009, 11（4）：351-356.

［3］Mackinnon SE.Double and multiple"crush" syndrome.Double and multiple entr-apment neuropathies.Hand Clin,1992,8（2）：369-390. ［4］朱全,浦均宗,張敏.游泳方法建立模擬過度訓練模型［J］.中國運動醫(yī)學雜志,1998,17 （2）：137-140.

［5］程瑞動,屠文展,操芬,等.電針對慢性坐骨神經壓迫性損傷大鼠神經病理學及背根神經節(jié)P2X3受體表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊,2012,30（1）：66-69.

［6］彭利,左連富,王順祥,等.肝癌組織中COX-2、VEGF、MMP-2、MMP-9的表達及相互關系的免疫組化研究［J］.實用腫瘤雜志,2005,（20）：134-135.

［7］Weidner N,Foi kmaan K J,Pozza F,et al.Tumoranglogenesis：anew significantand independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma［J］.Nat Cancer Inst,1992,84 （24）：1875-887.

［8］郭現(xiàn)輝,王珂,王鑫,等.電針對慢性坐骨神經結扎性損傷模型大鼠外周血清中TNF-OL、IL-1、IL-6表達的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志,2013,47（9）：66-69.

［9］Han M,Huang RY,Du YM,et a1.Early intervention of ERK activation in the spinal cord can block initiation ofperipheralnerve injury-induced neuropathic pain in rats［J］. Sheng LiXue Bao,2011,63（2）：106-114.

［10］Weerasuriya A.Pattems of change in endoneurial capillary permeability and vascular space during nerve regeneration［J］.Brain Res,1990,510（1）：135-139.

［11］Podhajsky RJ,Myers RR.The vaseular response to nerve crush：relationship towallerian degeneration and regeneration［J］. BrainRes.1993,623（1）：117-123.

［12］楊米雄,鄭杰,裴君.運動療法對大鼠坐骨神經卡壓模型神經功能影響的評估［J］.中國臨床康復,2005,（45）：93-95.

［13］李健東,李學佩.手術創(chuàng)傷對家兔面神經微循環(huán)的影響［J］.微循環(huán)學雜志.2003,13（4）：13-15.

［14］張立寧,王興林.電刺激對周圍神經再生的影響［J］.中國康復理論與實踐,2006,12（7）：588-590.

［15］Clarkin CE,Gerstenfeld LC.VEGF and bone cell signal-ling： an essential vessel for communication［J］.Cell Biochem Funct,2013, 31：1-11.

［16］Bencke-C,Thelen A,Cramer T,et al.Impact ofmicrovesseldensity on lymph nodemetastasis and survival after curative resection of pancreatic cancer［J］.Surgery Today,2012,42 （2）：169-176.

［17］Hansen T F,Sorensen F B,Spindler K L,et al.Microvessel density and the association with single nucleotide polymorphisms of the vascular endothelial growth factor receptor 2 in patients with colorectal cancel［J］.Virchows Archiv,2010,456（3）：251-260.

Influence of com prehensive rehabilitation on them icrovascular generation of com pressed sciatic nerve in rat

Chen Feng,Du Zhensheng,Cao Huiping,AiMingyang,Zhao Yiqiang,SongWeiyong Songgang People'sHospitalofShenzhen City,Guangdong Province 518105

Objective：To explore the influence of rehabilitation training combined acupuncture therapy on the microvascular generation of compressed sciatic nerve in rat.Methods：40 cases ofmale SD ratswith successfulmodeling were random ly divided into four groups.The paraffin section ofmiddle specimen from compressed nerve in ratwere given immunohistochemical staining for CD34,vascular endothelialgrowth factor（VEGF）,the nervemicrovascular density（MVD）and VEGF expression were observed. Results：TheMVD and VEGF expression of the group B,group C,group Dwere higher than thatof the group A（P＜0.05）.The MVD and VEGF expression of the group D were higher than that of the group B and group C（P＜0.05）.Conclusion：Rehabilitation training and acupuncture therapy had promoting effecton themicrovascular generation of compressed sciatic nerve in rat,and the both jointhad bettereffect.

Rehabilitation training；Acupuncture therapy；Sciatic nerve；Nerve microvascular generation；Vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.24.1