徐軼彥

（福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州350025）

成纖維生長因子（Fibroblast growth factors FGFs）家族是一群具多種生理功能的生長因子，通過細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體將胞外信號(hào)傳到胞內(nèi)，其功能涉及胚胎發(fā)育、血管生成和傷口愈合等，對組織和細(xì)胞的增殖和分化起重要作用[1-2]。FGFs在哺乳動(dòng)物中至少有22個(gè)成員，從FGF1~23，在人類中沒有FGF15。FGF8是其中的一個(gè)成員，最初從雄激素依賴的小鼠乳腺癌細(xì)胞系SC-3克隆出來[3]。通過可變剪接，F(xiàn)GF8基因可轉(zhuǎn)錄加工成多種亞型。在小鼠中可產(chǎn)生FGF8a~h8種亞型，在人類中產(chǎn)生四種亞型：FGF8a、FGF8b、FGF8e和FGF8f[3-5]。本文利用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)人FGF8a，并對表達(dá)的人FGF8a進(jìn)行純化、復(fù)性及體外活性檢測。本研究將為進(jìn)一步了解FGF8a的功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

含F(xiàn)GF8a cDNA序列的質(zhì)粒pBluescript-FGF8a為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Top 10′被用于分子克隆；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS用于蛋白表達(dá)；T4DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶均購于TaKaRa公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow和Sephacryl S-200 HR購于美國通用公司；抗6×His一抗和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗購于中杉金橋(北京)生物技術(shù)；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 pET14b-FGF8a重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以克隆有FGF8a cDNA序列的質(zhì)粒pBluescript-FGF8a為模板，設(shè)計(jì)引物（上游引物：5′-GCCATATGGGCAGCCCCCGCTC-3′；下游引物：5′-CCGCTCGAGTTATCGGGGCTCGG-3′），擴(kuò)增FGF8a閱讀框序列。擴(kuò)增的序列連接到載體pET14b的NheI/XhoI位點(diǎn)上，與6×His標(biāo)簽在同一閱讀框。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化TOP10′感受態(tài)細(xì)胞，涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上篩選。鑒定后的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序確定表達(dá)序列和閱讀框的正確性。

1.2.2 重組人FGF8a在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)

轉(zhuǎn)化了pET14b-FGF8a重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，過夜培養(yǎng)的細(xì)菌以1‰的接菌量接到新鮮的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD=0.3~0.6時(shí)，加入終濃度約1mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)4h。10000rpm 4℃離心10min，收集菌體，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重組人FGF8a色譜純化和復(fù)性

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，7000rpm離心10min，收集包涵體。包涵體用20mmol/LTris-HCl，2mol/L尿素，2%TritonX-100洗滌30min，15000rpm離心10min，收集沉淀。洗滌后包涵體在室溫下用20mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素，0.1mol/L NaCl，pH8.0緩沖液進(jìn)行溶解2h，15000rpm離心30min，取上清。Ni Sepharose 6 Fast Flow柱用上樣緩沖液（20mmol/L Tris-HCl，8mol/L尿素，0.1mol/L NaCl，pH8.0）平衡。變性溶解后的上清以1ml/min的流速過Ni親和柱，隨后Ni柱用淋洗緩沖液（20mmol/LTris-HCl，8mol/L尿素，0.1mol/LNaCl，0.05mol/L咪唑，pH8.0）清洗非特異性吸附的雜蛋白。

采用在位復(fù)性的方式對變性后的重組人FGF8a進(jìn)行復(fù)性。具體做法如下：吸附有重組人FGF8a的Ni親和柱采用線性梯度的方式將尿素從8mol/L濃度逐漸下降到0mol/L，流速為0.1ml/min，梯度時(shí)間24h。隨著尿素濃度的逐漸下降，吸附在Ni上的重組人FGF8a開始復(fù)性。最終柱上的重組人FGF8a用洗脫緩沖液（20mmol/LTris-HCl，0.1mol/L NaCl，0.5mol/L咪唑，pH8.0）進(jìn)行洗脫。經(jīng)Ni純化的重組人FGF8a用Sephacryl S-200凝膠層析柱做進(jìn)一步純化和緩沖液更換。S-200 Sephocryl凝膠層析所用緩沖液為PBS，流速為1min/ml。收集重組人FGF8a洗脫峰，并用Bradford法對其進(jìn)行蛋白定量。

1.2.4 重組人FGF8a Western blot鑒定

待測樣品經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜上，條件100V，2h。5%脫脂奶粉封閉1h，在鼠抗6×His抗體中4℃孵育過夜。一抗孵育后的NC膜經(jīng)TTBS清洗三次，每次10min。隨后在堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗中孵育1h，膜清洗后用NBT/BCIP系統(tǒng)進(jìn)行顯色。

1.2.5 重組人FGF8a活性檢測

按文獻(xiàn)方法進(jìn)行[6],將NIH3T3細(xì)胞以500個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，在含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，去除未貼壁細(xì)胞，并向每孔中加入100μl的新鮮培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組中培養(yǎng)液中加入800μg/ml純化后的FGF8蛋白，空白對照加入等體積的PBS溶液，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h后MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 人FGF8a表達(dá)載體的構(gòu)建

利用特異性引物從克隆質(zhì)粒pBluescript-FGF8a中擴(kuò)增出FGF8a全長閱讀框序列（圖1）。擴(kuò)增片段5′端含NheI位點(diǎn)，3′端含XhoI位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)NheI和XhoI內(nèi)切酶消化后與NheI和XhoI雙酶切的原核表達(dá)載體pET14b進(jìn)行連接，構(gòu)建人FGF8a表達(dá)載體pET14b-FGF8a。表達(dá)載體中FGF8a序列在6×His序列下游，并與之同一閱讀框。因此，表達(dá)的重組人FGF8a蛋白N端將帶有6×His。表達(dá)序列與載體利用酶切技術(shù)對重組載體進(jìn)行鑒定。連接載體經(jīng)酶切鑒定正確后（圖2），進(jìn)行測序以確定表達(dá)序列和閱讀框是否正確。

圖1 PCR擴(kuò)增的人FGF8a片段電泳分析

圖2 FGF8a重組表達(dá)質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切鑒定

2.2 人FGF8a在大腸桿菌中有表達(dá)與純化

轉(zhuǎn)化了pET14b-FGF8a質(zhì)粒的宿主菌BL21(DE3)pLysS用1mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，4小時(shí)誘導(dǎo)后在預(yù)期分子量大小的位置產(chǎn)生明顯的蛋白條帶（圖3A）。Western blot鑒定該蛋白條帶為重組FGF8a（圖3B）。包涵體經(jīng)8M脲變性溶解后過Ni親和柱，并在柱上在位復(fù)性。Ni親和柱洗脫峰再經(jīng)Sephacryl S-200分子篩柱純化。經(jīng)Ni親和柱和Sephacryl S-200分子篩柱純化到的蛋白能被特異性抗原識(shí)別（圖4B），且純度達(dá)到電泳純（圖4A）。

圖3 人FGF8a在大腸桿菌中表達(dá)

圖4 人FGF8a純化

2.3 重組人FGF8a活性檢測

FGF在體外具有刺激細(xì)胞增殖的能力，據(jù)此特性，可對FGF的活性進(jìn)行檢測。傳代培養(yǎng)24h后的NIH3T3成纖維細(xì)胞分別加入純化后的重組FGF8a（800μg/ml）和PBS溶液，利用MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示，與加PBS對照組相比，加入重組FGF8a后，NIH3T3細(xì)胞分裂增殖顯著增加（圖5）。

圖5 重組人FGF8a活性檢測

3 討論

眾多研究表明，不同的FGF8亞型在人類胚胎發(fā)育過程中，在多種不同組織中表達(dá)，對器官的發(fā)育與形成起著重要作用。為得到大量人FGF8a蛋白用于功能研究，我們嘗試?yán)么竽c桿菌系統(tǒng)表達(dá)人FGF8a。結(jié)果表明人FGF8a能在大腸桿菌中大量表達(dá)，但重組表達(dá)的FGF8a以包涵體形式存在。包涵體中的多肽不具高級(jí)構(gòu)象，故無生理活性。為使大腸桿菌中表達(dá)的FGF8a有生理功能，可采用兩種方式：第一對包涵體中的多肽進(jìn)行體外復(fù)性；第二改變大腸桿菌的表達(dá)條件，增加胞質(zhì)中可溶性FGF8a的含量[7]。第二種方法雖可避免包涵體復(fù)性過程的煩瑣，但也產(chǎn)生了另外的問題，如表達(dá)量不高、增加純化難度等。在本研究中，我們采用了柱上在位復(fù)性的方式，發(fā)現(xiàn)柱上復(fù)性后的FGF8a經(jīng)洗脫后并不會(huì)出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，且整個(gè)復(fù)性過程操作簡單。因此，柱上在位復(fù)性方式對于某些蛋白復(fù)性可能是一種不錯(cuò)的選擇。

為方便純化，我們在表達(dá)的人FGF8a蛋白N端增加了6×His標(biāo)簽，經(jīng)Ni親和柱和凝膠過濾兩步色譜純化后，重組蛋白純度能達(dá)到電泳純（圖4）。純化的重組人FGF8a處理NIH3T3細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力與對照相比明顯增加，表明N端融合6×His標(biāo)簽的人FGF8a具有生理功能。

［1］Itoh N,Ornitz DM.Fibroblast growth factors:from molecular evolution to roles in development,metabolism and disease[J].JBiochem 2011,149(2):121-130.

［2］Ornitz DM,Itoh N.Fibroblast growth factors[Z].Genome Biol 2001,2(3):REVIEWS3005.

［］3Frank DU,Fotheringham LK,Brewer JA,Muglia LJ,Tristani-Firouzi M,Capecchi MR,Moon AM.An Fgf8 mouse mutant phenocopies human 22q11 deletion syndrome[J].Development 2002,129(19):4591-4603.

［4］Gemel J,Gorry M,Ehrlich GD,MacArthur CA.Structure and sequence of human FGF8[Z].Genomics 1996,35(1):253-257.

［5］Sunmonu NA,Li K,Li JY.Numerous isoforms of Fgf8 reflect its multiple roles in the developing brain[J].JCell Physiol 2011,226(7):1722-1726.

［6］Potula HH,Kathuria SR,Ghosh AK,Maiti TK,Dey S.Transient expression,purification and characterization of bioactive human fibroblast growth factor 8b in tobacco plants[J].Transgenic Res 2008,17(1):19-32.

［7］付燦.重組人成纖維細(xì)胞生長因子-8a在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)[J].菏澤學(xué)院學(xué)報(bào),2009,31(2):94-98.