張正禹,包文靜,岳蕊,楊根華(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650201)
絲核菌(Rhizoctonia spp.)常以菌絲或菌核的形態(tài)習(xí)居于土壤中,不產(chǎn)生任何無性孢子,在自然界中廣泛存在于土壤及各種不同類型的寄主植物上,許多類群屬于植物病原真菌,能侵染多種植物如水稻、玉米、大麥、小麥、大豆等引起嚴(yán)重的病害[1]。該類真菌種類繁多,根據(jù)營(yíng)養(yǎng)菌絲隔膜的結(jié)構(gòu),絲核菌可分成兩類:子囊絲核菌和擔(dān)子絲核菌(Ceratobasidium spp.);根據(jù)細(xì)胞核數(shù)量多少,擔(dān)子絲核菌又分為雙核和多核絲核菌;在擔(dān)子絲核菌中最有用的分類依據(jù)是菌絲融合群和 5.8S rDNA-ITS 序列[2-4]。
有關(guān)絲核菌DNA的提取,國(guó)內(nèi)外普遍采用CTAB提取法[5]和基因組 DNA 提取試劑盒法[6-8],這幾種方法共同缺點(diǎn)是需要大量菌體,操作步驟麻煩,需要耗費(fèi)大量的時(shí)間,效率較低,且在DNA提取過程中需要加入酚、氯仿、異戊醇等有機(jī)溶劑,這些有機(jī)溶劑大部分為有毒試劑,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員健康有害,也會(huì)污染周邊環(huán)境,同時(shí)提取試劑或試劑盒的價(jià)格昂貴,也增加了DNA提取成本。因此,探索一種快捷、安全、有效的DNA提取方法,用于絲核菌菌株大規(guī)模的分類鑒定及分子檢測(cè)顯得非常必要。
為建立一套快捷、安全、有效的絲核菌菌株DNA提取方法。筆者采用Chelex-100法提取絲核菌菌株DNA擴(kuò)增5.8S rDNA-ITS序列,以期得到整齊、明亮、清晰和專一性強(qiáng)、產(chǎn)量高的PCR條帶,為快捷、有效地對(duì)絲核菌菌株的大規(guī)模分類鑒定和分子檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。
1.1 材料 菌株:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存絲核菌菌株12株。雙核絲核菌菌株:J-4,X-4-3-1,J-25,X-4-6-1,BN-J-1,BN-J-2,BN-J-4,BNJ-5,BN-J-7,BN-J-8,BN-J-9;多核絲核菌菌株:BN-J-3。
試劑與儀器:Chelex-100、2 ×Power Taq PCR Master Mix,昆明碩陽(yáng)生物科技有限公司。引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')、ITS4(5'-TCCTCGCTTATTGATATGC-3')[9],由上海生工生物工程有限公司合成。EDC-810型PCR儀,東勝創(chuàng)新生物科技有限公司。
馬鈴薯瓊脂(PDA)培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15 g,補(bǔ)充蒸餾水至1 000 ml,pH自然,121℃高壓蒸汽滅菌30 min。
5%(W/V)Chelex-100 溶液:Chelex-100 5 g,ddH2O 100 ml,pH 7.0,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min,4 ℃保存。
1.2 方法 基因組DNA的提取采用Chelex-100法:用無菌竹簽從PDA培養(yǎng)基上挑取少量菌絲放入裝有50 μl 5%(W/V)菌Chelex-100溶液(pH 7.0)的PCR管中,在旋渦混合器上振蕩5 s,EDC-810型PCR儀中94℃加熱10 min,自然條件下冷卻至室溫后,12 000 r/min離心1 min。上清即為PCR模板,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
5.8 S rDNA-ITS片段擴(kuò)增:將Chelex-100法提取的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 25 μl包括:1 μl DNA 模板,12.5 μl 2 × Power Taq PCR Master Mix 溶液,正、反向引物各 1 μl(10 μmol/L),ddH2O 9.5 μl。反應(yīng)在EDC-810型PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min,51℃退火1 min,72℃延伸1 min,35次循環(huán);最后72℃延伸10 min。取5 μl PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠120 V電泳40 min,于凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR條帶質(zhì)量并拍照。
結(jié)果表明,所有雙核、多核絲核菌菌株采用Chelex-100法提取的基因組DNA,以其作為PCR擴(kuò)增模板,都能夠有效地?cái)U(kuò)增出5.8S rDNA-ITS序列,PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測(cè),條帶整齊、清晰、明亮,專一性強(qiáng),產(chǎn)量大,無雜帶,目的片段大小約700 bp(圖1),可以直接用于測(cè)序分析,符合預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果。PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果表明,PCR產(chǎn)物均能滿足測(cè)序要求,且無雜合或者高級(jí)結(jié)構(gòu),都能夠得到正確的序列,測(cè)序結(jié)果較為理想。
圖1 供試菌株5.8S rDNA-ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增結(jié)果
Chelex-100是一種化學(xué)螯合樹脂,能夠螯合多價(jià)離子,特別是對(duì)高價(jià)的金屬離子具有很高的親和力和螯合作用;在低離子強(qiáng)度、堿性以及煮沸的條件下,能夠使細(xì)胞膜破裂,蛋白質(zhì)變性,有效地除去非核酸類有機(jī)物,通過離心去除Chelex-100顆粒,使DNA與其結(jié)合的物質(zhì)分離。Chelex-100法廣泛應(yīng)用于細(xì)菌DNA提取[10],放線菌DNA 提取[11],血痕或全血DNA 提?。?2-13],動(dòng)物源飼料 DNA 提?。?4],植物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)模板DNA的制備[15]以及薯蕷植物炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)和枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的DNA提?。?6]等領(lǐng)域。關(guān)于Chelex-100法提取絲核菌菌株的DNA尚未見報(bào)道。
該研究采用Chelex-100法提取的絲核菌DNA能夠直接用于5.8S rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增模板,電泳條帶整齊、明亮、清晰,無雜帶,產(chǎn)量大,符合測(cè)序要求,測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確;具有快速簡(jiǎn)便、省時(shí)省力和經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn),在絲核菌的快速分類鑒定和分子檢測(cè)方面具有重要意義。
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