柴玉蘭，馬海明

（湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128）

豬mtDNA及其在遺傳育種中的應用

柴玉蘭*，馬海明

（湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，長沙 410128）

自1962年線粒體DNA (mitochondrial DNA， mtDNA) 首次通過電子顯微鏡直接被觀察到以來，便成為核外遺傳物質的研究熱點。隨著PCR、DNA測序、生物信息學等領域的快速發(fā)展，有關豬mtDNA的結構、遺傳特點、應用等各方面都已經積累了相當豐富的資料。豬線粒體DNA的長度約為16.7 kbp， 由1個非編碼D-Loop區(qū)和37個編碼基因組成，其結構排列十分緊湊，堿基使用節(jié)約、高效。mtDNA具有母系遺傳、自主遺傳、無組織特異性、進化速率快等特點，因此它在遺傳多樣性、起源進化、生產性能、繁殖性能、豬肉真?zhèn)舞b別等方面被廣泛地研究、應用。

1 特征

1.1 豬mtDNA的結構、大小

mtDNA由重鏈（H strand，H鏈）和輕鏈（L strand，L鏈）兩條鏈組成，呈雙鏈閉合環(huán)狀。1979年，人類線粒體基因組全部序列被測得后，其他哺乳動物的線粒體基因組全部序列也被先后測定。就豬的mtDNA而言，很多種豬種（如巴馬香豬、萊蕪黑豬、桃源黑豬、寧鄉(xiāng)豬、滇南小耳豬、榮昌豬、大圍子豬等等）mtDNA的全序列已被測出。豬mtDNA結構現已十分清楚，它是由1個非編碼D-Loop區(qū) (D-Loop region，又叫非控制區(qū)non-coding control region)和37個編碼基因組成。而37個編碼基因中，包含2個核糖體RNA (12S rRNA和16S rRNA)，13個蛋白質編碼基因 ( PCGs) 和22個轉運RNA (tRNA)。以大圍子豬mtDNA為例（表1）可以看出，豬mtDNA基因的結構排列十分緊湊，無內含子，基因間隔小，甚至閱讀框有交疊讀取的情況；堿基使用節(jié)約、高效，這些特點適應于細胞器的快速復制。

1.2 豬mtDNA的遺傳特點

1.2.1 母系遺傳

在生殖過程中，mtDNA通過豬卵細胞質傳遞給后代，不受公畜影響。雖然精子的少量線粒體會進入卵母細胞，但由于胚胎中存在一對精源線粒體的識別和降解系統(tǒng)，它們在胚胎發(fā)生早期就消失了。這種幾乎無基因重組、嚴格的母系遺傳方式，為母系起源、親緣關系等群體分析奠定了理論基礎。

1.2.2 自主遺傳

mtDNA能完成自我復制，能自主轉錄生成RNA，并編碼合成部分維持自身結構、功能所需的蛋白質，其遺傳具有很大的自主性。值得提出的是，mtDNA的遺傳也會受到核DNA的調控，主要通過向線粒體輸入核DNA編碼的蛋白質以及某些小RNA來實現。

1.2.3 組織特異性

細胞中mtDNA含量豐富，在同一個體中，不同組織中的mtDNA具有高度的均一性，即無組織特異性。但不同組織中的mtDNA的含量、斷裂程度不相同，因此不同組織中mtDNA提取的難易程度有所不同。實驗證明，從肝臟提取mtDNA難度最小。

1.2.4 進化速率

mtDNA的進化非?？?，其進化速率是染色體基因組進化速率的5～10倍。其主要原因，一方面在于mtDNA幾乎沒有與之相結合的組蛋白，處于“裸露”狀態(tài)，因而容易受到代謝產生的自由基、氧化物等中間物質的誘變或損傷；另一方面，線粒體中缺乏防止DNA復制錯誤和修復DNA損傷的酶，這都使mtDNA突變的可能性增加。同時，又由于核DNA承擔了細胞生長發(fā)育和新陳代謝的核心功能，選擇壓力大，而mtDNA承擔的功能少許多，選擇壓力較小，因此mtDNA的一些突變易被保留下來。

2 在遺傳育種中的應用

2.1 遺傳多樣性與豬種的起源、進化

早在20世紀90年代，就通過研究江西省、浙江省等地的豬mtDNA多態(tài)性充分探究了中國地方豬種遺傳多樣性。到目前，對中國地方豬種的起源分化基本已經達成以下共識：中國地方豬種遺傳多樣性貧乏。

盡管各豬種的外表特征差異明顯，但是它們的mtDNA在遺傳結構上沒有太大差異，這反映了它們母系起源上的一致性。的確，大多數研究表明，中國地方豬種都起源于亞洲野豬，亞洲野豬與歐洲野豬的進化、馴養(yǎng)相對獨立。但此結論也存在爭議，有研究指出琉球野豬、華北野豬的幾種單元型與亞洲家豬間并無直接聯(lián)系；而Souza等通過分析線粒體Cytb基因表明本地主要豬品種起源于2 個不同的歐洲母系支系。

2.2 豬的繁殖、育種

線粒體在體內處于新陳代謝和能量轉換的中心地位， 可產生體內約85%的 ATP，線粒體的能量傳遞能力可能受mtDNA的調控。S.K.Lee等的研究指出，線粒體的代謝活性和mtDNA的復制對豬卵母細胞的發(fā)育有重要影響。另有報道指出mtDNA 拷貝數的減少和轉錄水平的降低都可以影響呼吸鏈功能、ATP的產生，而ATP可以影響卵子的正常發(fā)育、成熟；其次，卵母細胞的ATP含量直接影響受精率，ATP含量過高或過低都可以引起受精的失?。辉俅?， 由于在胚胎發(fā)育的早期， 受精卵基因組尚未激活， 胚胎發(fā)育所需的能量供給及調控因子都來自母源的基因表達產物， 故其所有耗能主要依賴卵母細胞所攜帶的線粒體。Hongshan Ge等的研究進一步指出，mt DNA 拷貝數的減少，主要影響的是胚胎的發(fā)育潛力，而對卵母細胞成熟和體外受精影響相對較小。

表1 大圍子豬mtDNA的結構

在mtDNA標記輔助育種方面，趙興波等通過 PCR-RFLP方法研究豬mtDNA D-loop區(qū)，結果表明太湖豬、大白豬、北京黑豬、香豬、五指山豬、長白豬和杜洛克豬7個豬品種Acc Ⅳ 酶切位點的多態(tài)與太湖豬的高繁殖性能沒有直接的關系。

2.3 豬生產性能

Toelle等研究了杜洛克豬和大白豬的2個母系豬種的細胞質效應，其研究結果表明細胞質對出生重、斷奶重和背膘厚度都有較大的意義，據此得出豬mtDNA與生產性能密切相關的結論。

2.4 豬肉真?zhèn)舞b別

豬肉真實性檢測關系到經濟、宗教、食品安全或公共健康問題。自從2001年，BellagambaF利用 mtDNA的cytb基因產生的限制性位點成功鑒定出飼料中所使用的動物性脂肪的動物品種。近年來，基于mtDNA，在分子水平開發(fā)出了便宜、高效、靈敏、快捷的豬肉實驗室常規(guī)鑒定方法。

2012年，Haider等開發(fā)了基于線粒體細胞色素c 氧化酶亞基1基因 （COI）的PCR-RFLP方法，可以把豬肉從牛、雞、火雞、羊、水牛、駱駝和驢的生肉樣品區(qū)分開。

2013年，陳睿賾根據mtDNA確定了4對引物，建立了一種能夠一次性快速區(qū)分出綿羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉的多重PCR檢測方法，即使100 ℃沸水中將樣品煮熟10 min，對mtDNA不會造成大的損傷，此方法依然靈敏。同年，Karabasanavar等根據豬線粒體D-loop區(qū)引物，建立了高度特異性的PCR豬肉鑒定方法，實現豬組織的精確檢測。該方法可使豬組織區(qū)別于其他24種動物 (其中包含哺乳類、 鳥類、 嚙齒類動物和魚類)，靈敏度可達0.1%，這項技術可以用于檢測生豬肉、 加工豬肉中是否有摻假肉。

3 問題與展望

目前，mtDNA在豬繁殖性能、生產性能方面的研究比較少。趙興波等雖然提出了7個豬品種Acc Ⅳ 酶切位點的多態(tài)與太湖豬的高繁殖性能沒有直接關系的論點，但是，這個試驗的樣本量比較?。總€豬種只有12個樣本），因此該論點局限性較大，尚不能確認該位點變異是否就只存在于長白豬和部分大約克豬品種上。所以，充分利用豬mtDNA， 找到更多符合人類生產需求的有利基因，選育出更符合社會需要的品種，是我們現在面臨的挑戰(zhàn)。

略。

2015-07-07)

863項目（2011AA100304），湖南省自然科學杰出青年基金（13JJ1021）

柴玉蘭（1989-），女，漢族，湖南益陽人，在讀碩士，研究方向為豬的分子遺傳。

馬海明，教授，博導，E-mail: mahaiming2000@163.com