楊 凡，徐志文，李 萍，方和俊，郭 博，周遠成

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611134）

一例豬偽狂犬病病毒的分離鑒定及綜合防治措施

楊 凡，徐志文*，李 萍，方和俊，郭 博，周遠成

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 動物生物技術(shù)中心，四川 成都 611134）

無菌采集疑似豬偽狂犬病病豬腦組織，進行病毒的分離鑒定。經(jīng)PCR檢測為陽性的病料接種PK-15細胞進行病毒分離，將所分病毒暫命名為SC株。蝕斑實驗測定病毒滴度，并采用PCR和瓊擴實驗對其進行進一步鑒定。結(jié)果：PRV陽性病料接種PK-15細胞，傳至第5代后產(chǎn)生穩(wěn)定細胞病變，主要表現(xiàn)為細胞變圓、變亮、聚堆且可見典型的空斑，而對照組細胞貼壁生長良好；基于PRV gE基因的PCR檢測，擴增產(chǎn)物為378 bp，與預期目的條帶一致；用病毒蝕斑技術(shù)測定該分離株的滴度為2.65×104PFU/mL；瓊擴實驗顯示病毒原液至32倍稀釋后均能與PRV陽性血清形成可見沉淀線。以上結(jié)果均表明所送檢病豬為PRV陽性，據(jù)此為豬場提出綜合防治措施。

豬偽狂犬病病毒；分離鑒定；蝕斑實驗；瓊擴實驗；綜合防治

豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒（PRV）引起的多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。病豬以新生仔豬的急性死亡，4周齡以上的仔豬出現(xiàn)嘔吐、神經(jīng)癥狀和妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎及呼吸道癥狀為主要特征，可能引起人的輕微感染[1-3]。偽狂犬病的首次發(fā)現(xiàn)追溯到1813年的美國牛群中，隨后蔓延分布至全世界。1947年，我國首次報道PRV，目前該病已在國內(nèi)廣泛流行。本病尚無有效治療的藥物，只能靠接種疫苗預防，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[4]。2015年3月，四川崇州某規(guī)?；i場出現(xiàn)疑似偽狂犬病癥狀病豬，剖檢發(fā)現(xiàn)患病豬扁桃體、肝和脾均有散在的白色壞死點，腎臟有針尖大小出血點，且出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病豬腦脊液增多。本研究擬采集發(fā)病豬腦組織，進行基于PRV gE基因的PCR檢測，經(jīng)PCR檢測為陽性的病料接種PK-15細胞開展病毒分離，并將分離所得病毒株再次進行PCR檢測，用蝕斑實驗測定該病毒株的滴度，采用瓊擴實驗對該病毒進一步鑒定[5-9]。最后，根據(jù)相應診斷結(jié)果提出綜合防治措施。

1 材料和方法

1．1 實驗材料

1.1.1 病料采集

無菌采集崇州某豬場疑似PRV發(fā)病仔豬腦組織，經(jīng)研缽研磨后，加PBS配制1：5組織懸液，-20 ℃凍存。

1.1.2 實驗試劑

1 000單位雙抗；豬腎傳代細胞（PK-15）由實驗室保存；新生犢牛血清、DMEM細胞培養(yǎng)液購自Gibco公司；營養(yǎng)液（含10% 犢牛血清）、維持液（含2% 犢牛血清）、無鈣鎂水；飽和酚、氯仿、異丙醇、25% 冰乙醇；PRV陽性血清、PCR試劑盒等。

1．2 實驗方法

1.2.1 總DNA提取

取出凍存的組織懸液，-20 ℃和37 ℃，反復凍融3次，12 000 r/min 離心5 min；取400 μL上清液于無菌EP管中，加入500μL飽和酚，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入酚、氯仿各200 μL，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入酚、氯仿各200μL，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；取上清，加入400μL氯仿，混勻，靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離 心5 min；取上清，加入2倍體積異丙醇，輕搖約2 min，室溫靜置15 min，4℃，12000r/min離心15 min；棄上清液，加入1 mL 25% 冰乙醇洗滌沉淀及管壁，4 ℃，12 000 r/min離心5 min；棄上清液，室溫干燥沉淀后加入35μL ddH2O溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時，提取正常細胞的DNA做陰性對照。

1.2.2 病料PCR檢測

根 據(jù)GenBank上 發(fā) 表 的PRV gE基因保守序列設(shè)計合成1對引物，上游引物：5’-TGCTCG TGATGACCCACAAA-3’；下游引物：5’-TGTACACCGGCGAGAGCAT -3’，預期目的片段大小為378 bp。引物序列送至寶生物工程（大連）有限公司合成。

以提取的病毒DNA和正常細胞DNA為模板，按照下列PCR體系（10μL體系）進行擴增（見表1）。

反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，總共35個循環(huán)；72 ℃總延伸7 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄實驗結(jié)果。

表1 PCR擴增體系

1.2.3 病毒分離

取出凍存的組織懸液，反復凍融3次，離心取上清， 每1 mL上清液加1 000單位雙抗，置4 ℃處理過夜。

觀察培養(yǎng)的PK-15細胞生長狀況，當貼壁鋪滿單層，棄去培養(yǎng)液，無鈣鎂水洗2～3次，每瓶接種600μL處理好的組織懸液，對照組加入等量培養(yǎng)液。37 ℃吸附作用1 h，在此期間每隔15 min輕輕搖晃細胞瓶，使細胞和病毒液充分接觸。每瓶加入4 mL維持液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞病變達70%以上時收毒，即-20 ℃和37 ℃反復凍融3次，3 000 r/min離心15 min，取上清。將收取的病毒液繼續(xù)接種PK-15單層細胞傳代培養(yǎng)，先盲傳3代，直至產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞病變，收毒，-70 ℃凍存。

1.2.4 病毒PCR檢測

按1．2．1步驟，用酚、氯仿法抽提第5代、第7代病毒液總DNA，進行豬偽狂犬病病毒的PCR檢測。同時，應用本實驗室建立的豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）RT-PCR檢測方法和豬細小病毒（PPV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）PCR檢測方法，對第7代病毒液進行外源性病毒檢測。

1.2.5 蝕斑實驗

將六孔培養(yǎng)板中各孔已長滿單層細胞的的營養(yǎng)液吸棄，并將第7代病毒液連續(xù)進行10倍稀釋，選取10-2稀釋度，接種于六孔板各孔，每孔0．2 mL，輕輕搖動使病毒液均勻分布于細胞表面；置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，吸附1 h后，加入1% 甲基纖維素培養(yǎng)基，使其均勻覆蓋于細胞表面；置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～7 d；將覆蓋的甲基纖維素吸出棄之，用5%福爾馬林-1%結(jié)晶紫固定染色液固定和染色感染細胞，每孔加入1 mL；20 min后，用水沖洗，觀察細胞生長狀況，記錄蝕斑個數(shù)。

1.2.6 瓊擴實驗

用PBS配制1%瓊脂液，倒于平板內(nèi)制成凝膠。取打孔器在瓊脂凝膠上打梅花孔，孔徑為2 mm，中央孔與周圍孔間距約3 mm。將病毒液作2倍倍比稀釋，即1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256。中央孔滴加PRV陽性血清，周圍孔分別滴加稀釋后的病毒液。試驗設(shè)立對照組，中央孔滴加PRV陽性血清，周圍各孔均滴加等量的稀釋液。保持一定濕度，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱擴散24 h，觀察記錄沉淀線情況。

2 實驗結(jié)果

2．1 病料PCR檢測

用組織懸液抽提得到的DNA為模板，進行PCR引物擴增，設(shè)立PRV陰性和陽性對照，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker DL 2 000為標準，病料模板PCR擴增產(chǎn)物大小近似378 bp，擴增出的特異性片段與預期的大小一致（圖1）。

2．2 病毒分離

圖1 病料PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 PRV分離株在PK-15細胞上的變化

經(jīng)處理的PCR檢測為陽性的送檢病豬病料，接種PK-15細胞，盲傳3代未見明顯細胞病變。傳至第4代，接毒后46 h可見部分細胞變圓、變亮、脫落形成典型的空斑，對照組無細胞變圓、脫落；病毒傳至第5代以后，感染后38 h均可見80%左右細胞產(chǎn)生病變，主要表現(xiàn)為細胞變圓、變亮、聚堆且細胞病變初可見典型的空斑，即在PK-15細胞上產(chǎn)生穩(wěn)定細胞病變，對照組細胞貼壁良好，無明顯細胞病變（圖2）。

2．3 病毒PCR檢測

用第5、第7代病毒液抽提得到的DNA為模板，進行PCR引物擴增，設(shè)立PRV陰性和陽性對照，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DNA Marker DL2 000為標準，病毒液模板PCR擴增產(chǎn)物大小近似378 bp，擴增出的特異性片段與預期的大小一致，而外源性病 毒：CSFV、PRRSV、JEV、PPV、PCV2檢測均為陰性（圖3）。

2．4 蝕斑實驗

將收獲的第7代病毒液稀釋后，選擇10-2稀釋度接種PK-15細胞，接種后于37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)5 d，觀察并記錄蝕斑個數(shù)，測得六孔板中平均每孔形成53個蝕斑，則病毒懸液的蝕斑形成單位為2．65 ×104PFU/mL，即每1 mL病毒液滴度為2．65×104PFU（圖4）。

圖3 病毒PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖4 蝕斑實驗結(jié)果

2．5 瓊擴實驗

將病毒液作2倍倍比稀釋，實驗組中央孔滴加PRV陽性血清，周圍孔分別滴加稀釋后的病毒液。對照組中央孔滴加PRV陽性血清，周圍孔滴加等量的病毒稀釋液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：病毒原液至32倍稀釋均可見抗原抗體沉淀帶，從64倍稀釋度開始未見沉淀帶。對照組中均未見抗原抗體沉淀帶（見圖5）。

圖5 瓊擴實驗結(jié)果圖

3 結(jié)果討論

目前，我們已掌握許多對豬偽狂犬病病毒進行分離鑒定的方法，比如聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、蝕斑實驗（plaque formation test）、瓊脂凝膠免疫擴散實驗（agar gel immunodiffusion test，AGID）等。PCR技術(shù)又稱為體外基因擴增技術(shù)，誕生于1985年。Belak等應用gB基因引物率先建立了檢測PRV的PCR方法，檢測PRV與其他豬病毒病的多重PCR方法在近年也相繼建立。PCR具有敏感、快速、特異性強等優(yōu)點，還能活體檢測大批量樣品，目前在病毒鑒定上已經(jīng)得到廣泛運用[5，6]；AGID最早的應用是在1905年為研究利澤甘氏現(xiàn)象，1932年應用于細菌菌株的鑒定。Oudin于1946年在試管中進行了瓊擴實驗，對抗原混合物進行分析。Elek和 Ouchterlony于1948年分別建立了瓊脂雙向雙擴散法，可以同時鑒定、比較2種以上抗原或抗體，并對免疫擴散的理論依據(jù)相繼進行了研究。瓊擴試驗操作簡單、快捷，較適用于現(xiàn)場定性診斷和豬群陰性無感染者的普查，但結(jié)果易受pH、溫度等影響[7]。

PRV廣泛分布于機體各組織臟器中，比如扁桃體、肝臟、脾臟、肺和腎臟，但感染量以腦部三叉神經(jīng)節(jié)居多，因此實驗中主要采集病豬腦組織進行病毒的分離培養(yǎng)[10-11]。PRV具有泛嗜性，能在許多細胞中增殖，其中以ST細胞和PK-15細胞最敏感，在接種后24～72 h可出現(xiàn)典型的細胞病變，其次是BHK-21、MDBK、CEF等細胞。試驗中常用PK-15、BHK-21、MDBK等傳代細胞系分離培養(yǎng)該病毒[12]。

本實驗從病豬腦組織分離得到1株P(guān)RV，對該株病毒進行PCR 檢測、蝕斑實驗、瓊擴實驗后，證實該分離是成功的。針對以上實驗結(jié)果，對豬場建議主要包括以下幾個方面。第一，立即淘汰出現(xiàn)相應臨床特征的豬群，尤其是仔豬和種豬，同時采用2%～3%氫氧化鈉或熟石灰對相應圈舍地面、墻壁及周圍場地進行嚴格消毒處理。第二，抽取豬場中所有豬只血樣，并標記清楚。用PRV gE抗體檢測試劑盒進行抗體檢測，淘汰檢測結(jié)果呈陽性的全部豬只，陰性豬只進行嚴格隔離飼養(yǎng)。對測定結(jié)果為可疑的豬只先實行隔離飼養(yǎng)，然后重新采血檢測，根據(jù)檢測結(jié)果作出相應處理。第三，采集隔離飼養(yǎng)的所有健康豬群血樣，進行PRV gB抗體檢測，對所有陰性豬只緊急接種弱毒疫苗。第四，完善飼養(yǎng)管理制度。嚴禁從PRV陽性豬場引種，對待引進豬只采血檢測，確定為陰性后方可引進，最好自繁自養(yǎng)。豬群盡量做到全進全出。豬場實行封閉式管理，外來人員必須經(jīng)過相應消毒措施處理，隔離3 d后才可進入生產(chǎn)區(qū)。圈舍和周圍場地平時嚴格消毒，做好清潔衛(wèi)生。針對不同生長階段的豬群，合理搭配日糧。第五，制定合理免疫程序。仔豬出生3日齡后進行偽狂犬病疫苗滴鼻免疫，5～6周齡時肌肉注射1頭份，種公豬每半年普免1次，母豬產(chǎn)前3個月普免1次[13]。

[1] 譚詩文，冉懋韜，余波，等．偽狂犬病的研究進展[J]．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012 (3)： 14-17．

[2] 李春華，王英，蔣鳳英，等．豬偽狂犬病研究進展[J]． 動物醫(yī)學進展， 2008，29(3)： 68-72．

[3] 周泰沖．豬偽狂犬病毒對人的感染性問題(綜述)[J]．中國獸醫(yī)雜志，1987，13(1)： 44-47．

[4] 楊毅， 李文剛， 饒寶， 等． 豬偽狂犬病疫苗的研究進展[J]． 江西農(nóng)業(yè)學報，2010， 22(3)： 154-157．

[5] 趙麗， 崔保安， 方忠意， 等． PCR 檢測豬偽狂犬病病毒方法的研究[J]． 中國預防獸醫(yī)學報， 2007， 29(2)： 142-146．

[6] 王勤，郭萬柱．豬偽狂犬病 gE 基因的研究進展[J]．畜牧獸醫(yī)雜志，2002，21(5)： 18-20．

[7] 代明娟．應用瓊脂免疫擴散試驗檢測豬偽狂犬病[J]．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002 (7)： 40．

[8] 楊慶芳， 寧官保， 李俊達． 豬偽狂犬病病毒的分離鑒定[J]． 山西農(nóng)業(yè)科學，2011， 39(8)： 886-889．

[9] 王小玉， 李小歡， 郭萬柱， 等． 豬偽狂犬病病毒四川株的分離鑒定及UL43基因序列分析[J]． 畜牧與獸醫(yī)， 2010，42(10)： 1-10．

[10] Cheung A K． Investigation of pseudorabies virus DNA and RNA in trigeminal ganglia and tonsil tissues of latently infected swine[J]． AM J VET RES， 1995， 56(1)： 45-50．

[11] Brown J R T， Shin K， Fuller F．Detection of pseudorabies viral DNA in tonsillar epithelial cells of latently infected pigs[J]． AM J VET RES，1995， 56(5)： 587-594．

[12] 彭麗英， 倪建平， 張婉華， 等． 豬偽狂犬病病毒在不同細胞中增殖的研究[J]．上海農(nóng)業(yè)學報，2012，27(4)：67-69．

[13] 宋勝敏，孫秀月，鄭曉君，等．豬偽狂犬病的防治[J]．山東畜牧獸醫(yī)，2005(5)： 26-27．

2015-09-02）

四川省科技成果轉(zhuǎn)化項目（2013NC0014）；四川省科技支撐計劃（2013NZ0016）

楊凡（1992-），男，四川南充人，在讀碩士研究生，主要研究方向為動物傳染病病原分子生物學。E-mail：abtcyf@126.com

徐志文，教授，博士，預防獸醫(yī)學。E-mail：abtcxzw@126.com