亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        DAPI染色法在流式細(xì)胞術(shù)中檢測BHK-21細(xì)胞周期的探討

        2015-12-22 07:49:32俞宗佑楊孝樸甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730070中農(nóng)威特生物科技股份有限公司甘肅蘭州730046
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年23期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)染料細(xì)胞周期

        俞宗佑,楊孝樸(.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州730070;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅蘭州730046)

        細(xì)胞周期分析對反映一個(gè)細(xì)胞群體的增殖活性具有重要意義,利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量測定是細(xì)胞周期分析的重要手段,目前仍然是廣泛使用的方法之一。應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測,其結(jié)果不僅受樣品固有性、樣品的處理方法及熒光染色的影響,而且受分析方法的影響。目前,用于檢測細(xì)胞周期的染料種類較多,其中碘化丙啶(PI)是常用染料,但嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對中與之結(jié)合,無堿基特異性,因此染色前必須用核糖核酸酶A處理細(xì)胞,排除雙鏈 RNA 的干擾[1-2]。4,6-聯(lián)脒-2 苯基吲哚(DAPI)是DNA特異性的熒光染料,與DNA結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在A-T堿基區(qū),使用時(shí)無需用RnaseA處理細(xì)胞,但由于配置紫外激光源的流式細(xì)胞儀非常昂貴,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒有配備。因此,利用DAPI標(biāo)記DNA分析細(xì)胞周期的方法尚未成為常規(guī)檢測方法被普遍采納,也沒有簡單的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程可供參考[3-4]。筆者采用 DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞,探索簡便易行的DNA檢測技術(shù),檢測細(xì)胞周期中各期的DNA含量,以及時(shí)預(yù)測規(guī)?;囵B(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖活性的情況,為規(guī)?;?xì)胞培養(yǎng)的檢測奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器及試劑 NucleoCounter NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀、DAPI試劑盒,均為Chemometec公司產(chǎn)品;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,為INNOVATIS產(chǎn)品;懸浮培養(yǎng)細(xì)胞BHK-21,為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司馴化并保存。

        1.2 樣品的制備 將生長狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行傳代批式培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,以4×105個(gè)/ml的密度接種于含200 ml培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)三角瓶中,于37℃條件下150 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中,分別在24、48、60 h對細(xì)胞取樣,并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察,檢測細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力。將樣品用PBS沖洗2次,1 000 r/min離心5 min,棄上清液。用冰凍的70%無水乙醇固定,置于4℃條件下備用。

        1.3 染色與上機(jī)檢測 將處理好的細(xì)胞樣品,每份懸浮于0.5 ml DAPI染色液中,37℃避光染色5 min,取適量染色后的細(xì)胞樣加入到NC-Slide A8的檢測室中,將上樣后的NCSlide A8放置于NC3000主機(jī)的托盤中,進(jìn)行上機(jī)檢測。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細(xì)胞形態(tài) 在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),大多數(shù)細(xì)胞散在分布,單個(gè)細(xì)胞透亮,邊緣光滑,形態(tài)長良好。

        2.2 細(xì)胞生長濃度與活性 在起始濃度為4×105個(gè)/ml,經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng),0~48 h內(nèi)細(xì)胞密度逐漸呈上升趨勢,48 h后繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞濃度逐漸呈下降趨勢(圖1);細(xì)胞活性先有所增加,達(dá)到最大值后呈下降趨勢,直至細(xì)胞大部分死亡(圖2)。

        2.3 細(xì)胞周期分析 將DAPI染色后的BHK-21細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行檢測,經(jīng)NC-3000系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析,結(jié)果表明,48 h以前S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)呈上升趨勢,大部分細(xì)胞逐進(jìn)入DNA合成期;培養(yǎng)48 h后,S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)明顯呈下降趨勢(圖3)。

        3 討論

        細(xì)胞濃度與細(xì)胞活力都是監(jiān)測細(xì)胞質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)[5]。該試驗(yàn)細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明,在細(xì)胞培養(yǎng)到48 h,細(xì)胞S期和G2/M期含量逐漸呈上升趨勢,并達(dá)到最高值,同時(shí)這一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞密度也達(dá)到最大值,且細(xì)胞活力高達(dá)95%以上,二者的檢測結(jié)果相一致。該試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)開始階段,培養(yǎng)液中營養(yǎng)豐富,細(xì)胞在較低密度下生長,代謝活躍,大部分處在G0/G1期,為下一階段DNA合成S期貯備足夠營養(yǎng)物質(zhì)和能量,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞逐漸向DNA合成期過渡,完成DNA合成,最后進(jìn)入G2/M,細(xì)胞開始分裂增殖。該試驗(yàn)中細(xì)胞生長到72 h,大部分細(xì)胞被阻滯在G0/G1期,此期細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞不能在增殖,表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,細(xì)胞培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)大量被消耗,同時(shí)細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量副產(chǎn)物,這些因素都嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長[6-7]。因此,檢測細(xì)胞周期可預(yù)測下一個(gè)階段細(xì)胞生長趨勢與增殖情況,為規(guī)膜化細(xì)胞培養(yǎng)提共理論參考。

        細(xì)胞周期染色方法很多,筆者探討了DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞,結(jié)果表明DAPI是一種可靠的DNA檢測方法,并且其樣本制備更簡單、易行。這種染料可作為帶紫外激光器的分選儀上檢測DNA的最佳選擇。雖然PI的DNA染色效果好,適用于普通流式細(xì)胞儀上檢測(488 nm激發(fā)),但由于其具有毒性,污染后不易清除且不能標(biāo)記活體細(xì)胞等局限性,因此,不適用于在分選儀上檢測[8-9]。

        筆者借助NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀所建立的DAPI染色法簡單易行,不必加通透劑,也不分離核,是一種適用于多參數(shù)分析的檢測細(xì)胞DNA含量的方法,而且實(shí)驗(yàn)流程更簡單、快速,可作為具備紫外激光器的流式細(xì)胞儀上首選的DNA熒光染料。能夠準(zhǔn)確檢測細(xì)胞周期,為規(guī)?;?xì)胞培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞生長狀態(tài)提供一種良好的檢測方法。

        [1]劉錫娟,丁慧榮,張宏.用DAPI和Hoechast33342染色法檢測DNA的流式細(xì)胞方法探討[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,42(4):480 -484.

        [2]賈永蕊.流式細(xì)胞術(shù)在DNA檢測中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)學(xué)裝備,2010,7(4):4-6.

        [3]閆虹.流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2008,19(5):4 -6.

        [4]CAMPLEJOHN R S,MACARTNERY J C,MORRIS R W,et al.Measurement of phase fractions in lymphoid tissue com paring fresh verus paraffin embedded tissue and 4,6-diamidino-2-phenylindoledihy drochlorde verus propiumiodide staining[J].Cytometry,1989,10(4):410 -416.

        [5]URBICH C,DIMMELER S.Endothelial progenitor cells:characterization and role in vascular biology[J].Cire Res,2004,95(4):343 -353.

        [6]KRISHAN A,DANDEKAR P D.DAPI fluorescence in nuclei isolated from tumors[J].J Hislochem Cytochem,2005,53(8):1033 -1036.

        [7]KAPUSCINSKI J.DAPI:a DNA-specfific fluorescence probe[J].Bio-tech Histochem,1995,70(5):220 -223.

        [8]MCLNTIRE T L,GOLGDEY S H,BENSON N A,et al.Flow cytometric analysis of DNA in cells obtained from deparaffinized fomalin fixed lymphoid tissues[J].Cytometry,1987,8(5):474 -478.

        [9]FENG Y D,TAO D D,QIN J C,et al.A novel three-parameter flow cytometric analysis for cell cycle[J].Chin Gem J Clinic Oncol,2005,4(2):76-82.

        猜你喜歡
        細(xì)胞培養(yǎng)染料細(xì)胞周期
        新染料可提高電動(dòng)汽車安全性
        中國染料作物栽培史
        紅霉素聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
        酶解大豆蛋白的制備工藝研究及其在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用研究
        染料、油和水
        NSCLC survivin表達(dá)特點(diǎn)及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
        X線照射劑量率對A549肺癌細(xì)胞周期的影響
        新型含1,2,3-三氮唑的染料木素糖綴合物的合成
        3種陰離子交換色譜固定相捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞生成素的效果比較
        色譜(2015年6期)2015-12-26 01:57:32
        熊果酸對肺癌細(xì)胞株A549及SPCA1細(xì)胞周期的抑制作用
        蜜桃传媒网站在线观看| 国产AⅤ无码久久丝袜美腿| 欧美精品高清在线xxxx| 中国黄色偷拍视频二区| 亚洲av综合色区无码一区| 美女视频黄的全免费视频网站| 无码日韩人妻AV一区免费| 日韩精品一区二区三区含羞含羞草 | 亚洲欧美国产日韩字幕| 亚洲av高清资源在线观看三区| 亚洲av高清一区二区在线观看| 久久久www成人免费毛片| 久久99精品久久久久久| 东京热无码人妻中文字幕| 91l视频免费在线观看| 2019最新中文字幕在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品| 草莓视频中文字幕人妻系列| 亚洲国产成人av毛片大全| 四虎成人精品国产永久免费无码| 人妻丰满熟妇av无码处处不卡| 欧美深夜福利视频| 国产亚洲一本二本三道| 亚洲av无码专区在线观看下载| 欧美性猛交xxxx乱大交蜜桃| 色老汉亚洲av影院天天精品| 中文字幕一区久久精品| 久久香蕉国产线熟妇人妻| 亚洲国产欧美日韩一区二区| 日韩一区二区中文字幕| 亚洲va中文字幕无码一二三区| 久久乐国产精品亚洲综合| 久久午夜无码鲁丝片直播午夜精品| 国产一区二区三区的区| 亚洲热妇无码av在线播放| 精品国产福利在线观看网址2022| 国产精品很黄很色很爽的网站| 国产成人av无码精品| 国产精品va无码一区二区| 亚洲区精选网址| 国产视频激情在线观看|