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        DAPI染色法在流式細(xì)胞術(shù)中檢測(cè)BHK-21細(xì)胞周期的探討

        2015-12-22 07:49:32俞宗佑楊孝樸甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院甘肅蘭州730070中農(nóng)威特生物科技股份有限公司甘肅蘭州730046
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年23期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)染料細(xì)胞周期

        俞宗佑,楊孝樸(.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州730070;2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司,甘肅蘭州730046)

        細(xì)胞周期分析對(duì)反映一個(gè)細(xì)胞群體的增殖活性具有重要意義,利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量測(cè)定是細(xì)胞周期分析的重要手段,目前仍然是廣泛使用的方法之一。應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè),其結(jié)果不僅受樣品固有性、樣品的處理方法及熒光染色的影響,而且受分析方法的影響。目前,用于檢測(cè)細(xì)胞周期的染料種類較多,其中碘化丙啶(PI)是常用染料,但嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對(duì)中與之結(jié)合,無堿基特異性,因此染色前必須用核糖核酸酶A處理細(xì)胞,排除雙鏈 RNA 的干擾[1-2]。4,6-聯(lián)脒-2 苯基吲哚(DAPI)是DNA特異性的熒光染料,與DNA結(jié)合是非嵌入式的,主要結(jié)合在A-T堿基區(qū),使用時(shí)無需用RnaseA處理細(xì)胞,但由于配置紫外激光源的流式細(xì)胞儀非常昂貴,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒有配備。因此,利用DAPI標(biāo)記DNA分析細(xì)胞周期的方法尚未成為常規(guī)檢測(cè)方法被普遍采納,也沒有簡(jiǎn)單的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程可供參考[3-4]。筆者采用 DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞,探索簡(jiǎn)便易行的DNA檢測(cè)技術(shù),檢測(cè)細(xì)胞周期中各期的DNA含量,以及時(shí)預(yù)測(cè)規(guī)?;囵B(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖活性的情況,為規(guī)?;?xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器及試劑 NucleoCounter NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀、DAPI試劑盒,均為Chemometec公司產(chǎn)品;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀,為INNOVATIS產(chǎn)品;懸浮培養(yǎng)細(xì)胞BHK-21,為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司馴化并保存。

        1.2 樣品的制備 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行傳代批式培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,以4×105個(gè)/ml的密度接種于含200 ml培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)三角瓶中,于37℃條件下150 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中,分別在24、48、60 h對(duì)細(xì)胞取樣,并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察,檢測(cè)細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力。將樣品用PBS沖洗2次,1 000 r/min離心5 min,棄上清液。用冰凍的70%無水乙醇固定,置于4℃條件下備用。

        1.3 染色與上機(jī)檢測(cè) 將處理好的細(xì)胞樣品,每份懸浮于0.5 ml DAPI染色液中,37℃避光染色5 min,取適量染色后的細(xì)胞樣加入到NC-Slide A8的檢測(cè)室中,將上樣后的NCSlide A8放置于NC3000主機(jī)的托盤中,進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 細(xì)胞形態(tài) 在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),大多數(shù)細(xì)胞散在分布,單個(gè)細(xì)胞透亮,邊緣光滑,形態(tài)長(zhǎng)良好。

        2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)濃度與活性 在起始濃度為4×105個(gè)/ml,經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng),0~48 h內(nèi)細(xì)胞密度逐漸呈上升趨勢(shì),48 h后繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞濃度逐漸呈下降趨勢(shì)(圖1);細(xì)胞活性先有所增加,達(dá)到最大值后呈下降趨勢(shì),直至細(xì)胞大部分死亡(圖2)。

        2.3 細(xì)胞周期分析 將DAPI染色后的BHK-21細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)NC-3000系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析,結(jié)果表明,48 h以前S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)呈上升趨勢(shì),大部分細(xì)胞逐進(jìn)入DNA合成期;培養(yǎng)48 h后,S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)明顯呈下降趨勢(shì)(圖3)。

        3 討論

        細(xì)胞濃度與細(xì)胞活力都是監(jiān)測(cè)細(xì)胞質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)[5]。該試驗(yàn)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明,在細(xì)胞培養(yǎng)到48 h,細(xì)胞S期和G2/M期含量逐漸呈上升趨勢(shì),并達(dá)到最高值,同時(shí)這一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞密度也達(dá)到最大值,且細(xì)胞活力高達(dá)95%以上,二者的檢測(cè)結(jié)果相一致。該試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)開始階段,培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)豐富,細(xì)胞在較低密度下生長(zhǎng),代謝活躍,大部分處在G0/G1期,為下一階段DNA合成S期貯備足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞逐漸向DNA合成期過渡,完成DNA合成,最后進(jìn)入G2/M,細(xì)胞開始分裂增殖。該試驗(yàn)中細(xì)胞生長(zhǎng)到72 h,大部分細(xì)胞被阻滯在G0/G1期,此期細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞不能在增殖,表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量被消耗,同時(shí)細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量副產(chǎn)物,這些因素都嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長(zhǎng)[6-7]。因此,檢測(cè)細(xì)胞周期可預(yù)測(cè)下一個(gè)階段細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)與增殖情況,為規(guī)膜化細(xì)胞培養(yǎng)提共理論參考。

        細(xì)胞周期染色方法很多,筆者探討了DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞,結(jié)果表明DAPI是一種可靠的DNA檢測(cè)方法,并且其樣本制備更簡(jiǎn)單、易行。這種染料可作為帶紫外激光器的分選儀上檢測(cè)DNA的最佳選擇。雖然PI的DNA染色效果好,適用于普通流式細(xì)胞儀上檢測(cè)(488 nm激發(fā)),但由于其具有毒性,污染后不易清除且不能標(biāo)記活體細(xì)胞等局限性,因此,不適用于在分選儀上檢測(cè)[8-9]。

        筆者借助NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀所建立的DAPI染色法簡(jiǎn)單易行,不必加通透劑,也不分離核,是一種適用于多參數(shù)分析的檢測(cè)細(xì)胞DNA含量的方法,而且實(shí)驗(yàn)流程更簡(jiǎn)單、快速,可作為具備紫外激光器的流式細(xì)胞儀上首選的DNA熒光染料。能夠準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞周期,為規(guī)?;?xì)胞培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)提供一種良好的檢測(cè)方法。

        [1]劉錫娟,丁慧榮,張宏.用DAPI和Hoechast33342染色法檢測(cè)DNA的流式細(xì)胞方法探討[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,42(4):480 -484.

        [2]賈永蕊.流式細(xì)胞術(shù)在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備,2010,7(4):4-6.

        [3]閆虹.流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床,2008,19(5):4 -6.

        [4]CAMPLEJOHN R S,MACARTNERY J C,MORRIS R W,et al.Measurement of phase fractions in lymphoid tissue com paring fresh verus paraffin embedded tissue and 4,6-diamidino-2-phenylindoledihy drochlorde verus propiumiodide staining[J].Cytometry,1989,10(4):410 -416.

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        [7]KAPUSCINSKI J.DAPI:a DNA-specfific fluorescence probe[J].Bio-tech Histochem,1995,70(5):220 -223.

        [8]MCLNTIRE T L,GOLGDEY S H,BENSON N A,et al.Flow cytometric analysis of DNA in cells obtained from deparaffinized fomalin fixed lymphoid tissues[J].Cytometry,1987,8(5):474 -478.

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