俞宗佑，楊孝樸(．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070;2．中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州730046)

細(xì)胞周期分析對反映一個(gè)細(xì)胞群體的增殖活性具有重要意義，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量測定是細(xì)胞周期分析的重要手段，目前仍然是廣泛使用的方法之一。應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，其結(jié)果不僅受樣品固有性、樣品的處理方法及熒光染色的影響，而且受分析方法的影響。目前，用于檢測細(xì)胞周期的染料種類較多，其中碘化丙啶(PI)是常用染料，但嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對中與之結(jié)合，無堿基特異性，因此染色前必須用核糖核酸酶A處理細(xì)胞，排除雙鏈 RNA 的干擾［1－2］。4，6-聯(lián)脒-2 苯基吲哚(DAPI)是DNA特異性的熒光染料，與DNA結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在A－T堿基區(qū)，使用時(shí)無需用RnaseA處理細(xì)胞，但由于配置紫外激光源的流式細(xì)胞儀非常昂貴，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒有配備。因此，利用DAPI標(biāo)記DNA分析細(xì)胞周期的方法尚未成為常規(guī)檢測方法被普遍采納，也沒有簡單的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程可供參考［3－4］。筆者采用 DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞，探索簡便易行的DNA檢測技術(shù)，檢測細(xì)胞周期中各期的DNA含量，以及時(shí)預(yù)測規(guī)?；囵B(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖活性的情況，為規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)的檢測奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 儀器及試劑 NucleoCounter NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀、DAPI試劑盒，均為Chemometec公司產(chǎn)品;細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，為INNOVATIS產(chǎn)品;懸浮培養(yǎng)細(xì)胞BHK-21，為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司馴化并保存。

1．2 樣品的制備 將生長狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行傳代批式培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以4×105個(gè)/ml的密度接種于含200 ml培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)三角瓶中，于37℃條件下150 r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，分別在24、48、60 h對細(xì)胞取樣，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察，檢測細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力。將樣品用PBS沖洗2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用冰凍的70%無水乙醇固定，置于4℃條件下備用。

1．3 染色與上機(jī)檢測 將處理好的細(xì)胞樣品，每份懸浮于0．5 ml DAPI染色液中，37℃避光染色5 min，取適量染色后的細(xì)胞樣加入到NC-Slide A8的檢測室中，將上樣后的NCSlide A8放置于NC3000主機(jī)的托盤中，進(jìn)行上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與分析

2．1 細(xì)胞形態(tài) 在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞散在分布，單個(gè)細(xì)胞透亮，邊緣光滑，形態(tài)長良好。

2．2 細(xì)胞生長濃度與活性 在起始濃度為4×105個(gè)/ml，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，0～48 h內(nèi)細(xì)胞密度逐漸呈上升趨勢，48 h后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度逐漸呈下降趨勢(圖1);細(xì)胞活性先有所增加，達(dá)到最大值后呈下降趨勢，直至細(xì)胞大部分死亡(圖2)。

2．3 細(xì)胞周期分析 將DAPI染色后的BHK-21細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行檢測，經(jīng)NC-3000系統(tǒng)對細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果表明，48 h以前S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)呈上升趨勢，大部分細(xì)胞逐進(jìn)入DNA合成期;培養(yǎng)48 h后，S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)明顯呈下降趨勢(圖3)。

3 討論

細(xì)胞濃度與細(xì)胞活力都是監(jiān)測細(xì)胞質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)［5］。該試驗(yàn)細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)到48 h，細(xì)胞S期和G2/M期含量逐漸呈上升趨勢，并達(dá)到最高值，同時(shí)這一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞密度也達(dá)到最大值，且細(xì)胞活力高達(dá)95%以上，二者的檢測結(jié)果相一致。該試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)開始階段，培養(yǎng)液中營養(yǎng)豐富，細(xì)胞在較低密度下生長，代謝活躍，大部分處在G0/G1期，為下一階段DNA合成S期貯備足夠營養(yǎng)物質(zhì)和能量，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸向DNA合成期過渡，完成DNA合成，最后進(jìn)入G2/M，細(xì)胞開始分裂增殖。該試驗(yàn)中細(xì)胞生長到72 h，大部分細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，此期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞不能在增殖，表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)大量被消耗，同時(shí)細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，這些因素都嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長［6－7］。因此，檢測細(xì)胞周期可預(yù)測下一個(gè)階段細(xì)胞生長趨勢與增殖情況，為規(guī)膜化細(xì)胞培養(yǎng)提共理論參考。

細(xì)胞周期染色方法很多，筆者探討了DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞，結(jié)果表明DAPI是一種可靠的DNA檢測方法，并且其樣本制備更簡單、易行。這種染料可作為帶紫外激光器的分選儀上檢測DNA的最佳選擇。雖然PI的DNA染色效果好，適用于普通流式細(xì)胞儀上檢測(488 nm激發(fā))，但由于其具有毒性，污染后不易清除且不能標(biāo)記活體細(xì)胞等局限性，因此，不適用于在分選儀上檢測［8－9］。

筆者借助NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀所建立的DAPI染色法簡單易行，不必加通透劑，也不分離核，是一種適用于多參數(shù)分析的檢測細(xì)胞DNA含量的方法，而且實(shí)驗(yàn)流程更簡單、快速，可作為具備紫外激光器的流式細(xì)胞儀上首選的DNA熒光染料。能夠準(zhǔn)確檢測細(xì)胞周期，為規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞生長狀態(tài)提供一種良好的檢測方法。

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