孫素玲，張 龍，郭 建 (安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽233100)

恩諾沙星是人工合成的喹諾酮類藥物的第3代產(chǎn)品，為動物專用抗菌劑。由于它具有廣譜、高效、組織穿透力強等優(yōu)點，而被廣泛用于治療、預(yù)防動物疾病和促進動物生長。但是，恩諾沙星在動物體內(nèi)的殘留消除緩慢，殘留于食品中的恩諾沙星在高溫下不易分解［1］，長期食用會危害人體健康。歐盟(EC)、WHO和我國等都制定了動物性食品中恩諾沙星的最高殘留限量(MRL)［2-3］，并加強了對該藥在動物性食品中殘留的檢測和監(jiān)督。

目前，肉食品中恩諾沙星殘留的檢測方法有微生物法、色譜分析法和免疫分析法等，其中免疫分析法具有較高的專一性和靈敏度，是一種很有前途的藥物殘留快速檢測方法。恩諾沙星抗體的制備是建立恩諾沙星殘留免疫學(xué)檢測方法的關(guān)鍵性步驟，嚴(yán)重影響恩諾沙星殘留免疫分析法的檢測效果。目前，關(guān)于恩諾沙星合成抗原的制備與鑒定［4］、恩諾沙星抗體的制備報道很多［5-8］，但尚未見到關(guān)于恩諾沙星合成抗原免疫對動物機體影響的報道，為此，筆者研究了恩諾沙星合成抗原免疫對小鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶活性的影響，以期為評價恩諾沙星合成抗原免疫對動物機體的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物。成年健康的昆明種小鼠20只，體重20～25 g，清潔級，由安徽科技學(xué)院試驗動物中心提供，觀察飼養(yǎng)1周。

1.1.2 器材。DY89-1型電動玻璃勻漿機，為寧波新芝科器研究所產(chǎn)品;JB-1A攪拌器(雷磁)，為上海夢漢實業(yè)有限公司產(chǎn)品;L216G臺式高速冷凍離心機，為上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品;S53型紫外可見光分光光度計，為上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑。卡介苗，購自上海生物制品研究所;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定試劑盒和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。恩諾沙星 (含量99.9%)，購自江西快康動物保健品有限公司。福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑由安徽科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)試驗室自行配制。恩諾沙星抗原由安徽科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室自行合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物免疫。20只小鼠隨機分為2組，每組10只。試驗組，兩側(cè)腹部皮下分點注射含福氏完全佐劑的抗原乳劑2 ml/只，此后每隔2周注射含福氏不完全佐劑抗原乳劑1 ml/只，共免疫4次;對照組，注射同劑量的滅菌生理鹽水。試驗期間，2組管理條件相同。

1.2.2 檢樣的采集與處理。最后1次免疫后10 d，停食24 h，不停水。頸椎脫臼處死，剖開腹腔取出肝臟。參照參考文獻［9］的方法，制備肝組織勻漿。

1.2.3 肝組織勻漿中蛋白含量的測定(雙縮脲法)。參照文獻［10］的方法進行標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線的繪制，并得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。根據(jù)樣本的吸光度和回歸方程，計算出肝組織勻漿中蛋白含量。

1.2.4 AST活性和ALT活性的測定。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程。按照試劑盒說明書進行操作，以各管吸光度值減去零管吸光度值的差值為Y軸，以相應(yīng)的卡門氏單位為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得相應(yīng)回歸方程。

1.2.4.2 AST活性和ALT活性的測定。按照試劑盒說明書操作，將測定管吸光度值減去對照管吸光度值之差代入回歸方程求出相應(yīng)的AST/ALT活性卡門氏單位。根據(jù)AST/ALT活性卡門氏單位和組織勻漿蛋白質(zhì)含量，按照以下公式計算出肝臟組織AST/ALT活性:

肝臟組織中AST/ALT活性(U/mg prot)=肝臟組織勻漿AST/ALT活性卡門氏單位/肝臟組織勻漿蛋白含量(mg prot/ml)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t檢驗分析差異顯著性，P＜0.05表示差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝組織勻漿中的蛋白含量 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的吸光度值，計算出的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的回歸方程為:

式中，Y為蛋白質(zhì)含量，X為吸光度。

根據(jù)樣本的吸光度，根據(jù)回歸方程計算出蛋白質(zhì)含量。

2.2 肝組織勻漿中AST活性和ALT活性

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。根據(jù)AST標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，得出AST的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:

根據(jù)ALT標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度，計算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:

2.2.2 肝組織勻漿中AST和ALT活性。將樣本的吸光度值分別代入式(2)和(3)，計算出的樣本AST和ALT活性卡門氏單位。然后，再計算出樣本 AST活性和ALT活性(表1～2)。

表1 各樣本的蛋白含量和AST活性

2.3 恩諾沙星免疫對AST和ALT活性的影響 由表3可知，試驗組肝臟組織AST活性略有降低，但與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，因此恩諾沙星免疫小鼠對肝臟組織AST活性沒有明顯影響。與對照組相比，試驗組小鼠肝臟微粒體中ALT活性明顯降低，差異極顯著(P＜0.01)。

3 討論

ALT和AST是目前最常用的肝功能檢測指標(biāo)。ALT主要存在于肝臟、心臟和骨骼肌中。AST在心肌細胞中含量最高，其次為肝臟。因此，筆者選擇了肝臟組織勻漿作為檢樣。該試驗結(jié)果表明，試驗組肝臟組織AST活性略有降低，但與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。這說明肝細胞的線粒體仍保持完整，因為肝內(nèi)的AST有2種同工酶，sAST分布于肝細胞漿內(nèi)，mAST分布于肝細胞線粒體中，AST只有1/5存在于肝細胞漿中，約有4/5在線粒體。該試驗結(jié)果表明，與對照組相比，試驗組小鼠肝臟微粒體中ALT活性明顯降低，差異極顯著(P＜0.01)，說明用恩諾沙星合成抗原對小鼠進行4次免疫會損傷肝細胞，因為ALT主要分布在肝細胞漿內(nèi)，雖然ALT也有可溶性胞漿ALT(s-ALT)和線粒體ALT(m-ALT)2種同工酶，但以s-ALT為主，m-ALT僅占小部分。

表2 各樣本的蛋白含量和ALT活性

表3 恩諾沙星合成免疫對肝臟組織轉(zhuǎn)氨酶活性的影響(±s)

表3 恩諾沙星合成免疫對肝臟組織轉(zhuǎn)氨酶活性的影響(±s)

注:＊＊表示與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

組別 AST活性∥U/mg prot ALT活性∥U/mg prot對照組384.34 ±74.06 934.92 ±117.94試驗組 358.04 ±48.63 523.78 ±94.64＊＊

該試驗中對照組AST/ALT的比值為0.41，試驗組AST/ALT的比值為0.68，試驗組AST/ALT的比值有所提高，但都低于1，也說明用恩諾沙星合成抗原對小鼠進行4次免疫會損傷肝細胞，但肝細胞的線粒體仍保持完整。

4 結(jié)論

恩諾沙星合成抗原免疫對小鼠肝臟組織ALT活性有抑制作用，但對AST活性沒有明顯影響。筆者只測定了肝臟組織勻漿中ALT和AST活性，未進行肝臟組織微觀上的病理變化觀察，其作用機理還有待進一步研究。

［1］LOLO M，PEDREIRA S，MIRANDA J M，et al.Effect of cooking on enrofloxacin residues in chicken tissue［J］.Food Addit Contam，2006，23(10):988-993.

［2］歐洲議會歐盟理事會.Regulation(EC)No 470/2009 of the European Parliament and of the Council［S］.2009.

［3］農(nóng)業(yè)部公告2002第235號:動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.2002.

［4］宓曉黎，李利東，黃麗俊，等.恩諾沙星免疫抗原的制備與鑒定［J］.中國動物檢疫，2010，27(6):43-45.

［5］劉紅，曾振靈，楊桂香，等.恩諾沙星單克隆抗體的制備及其鑒定［J］.中國獸藥雜志，2006，40(10):5-8.

［6］劉春娥，林洪，曹立民.漁藥恩諾沙星完全抗原合成方法及效果的研究［J］.水產(chǎn)學(xué)報，2005，29(4):535-539.

［7］趙銀麗，王建華，王自良，等.恩諾沙星單克隆抗體的制備及ciELISA試劑盒的研制［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2009，37(2):33-39.

［8］趙銀麗，王建華，王自良，等.抗恩諾沙星單克隆抗體雜交瘤細胞株的篩選及競爭ELISA試劑盒的研制［J］.核農(nóng)學(xué)報，2008，22(6):898-903.

［9］王心如，周宗燦，石年，等.毒理學(xué)試驗方法與技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:153-154.

［10］陳鈞輝，陶力，李俊，等.生物化學(xué)試驗［M］.北京:科學(xué)出版社，2003:197-199.