王 琪，于曉南

(1.天津城建大學(xué)建筑學(xué)院，天津300384;2.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，北京100083;3.國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心，北京100083)

芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)為芍藥科芍藥屬的多年生宿根草本植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，其品種多樣，花色各異，在寒冷地區(qū)的園林應(yīng)用中具有良好前景。

目前，關(guān)于芍藥屬植物抗寒性方面的研究多集中于牡丹組，而對(duì)芍藥的抗寒生理研究存在大量空白。金研銘等［1］對(duì)由菏澤引種至沈陽(yáng)的7個(gè)牡丹品種進(jìn)行抗寒性分析，認(rèn)為電導(dǎo)法、牡丹體內(nèi)的束縛水含量及束縛水/自由水比值都能很好地鑒別不同品種的抗寒性。岳樺等［2］對(duì)引入黑龍江地區(qū)的10個(gè)紫斑牡丹品種在自然越冬期間的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量等生理生化指標(biāo)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)10個(gè)品種經(jīng)過低溫鍛煉后，丙二醛含量和可溶性糖含量呈不同程度的增加。鞠志新［3］以牡丹組3個(gè)品種群的12個(gè)品種為試材進(jìn)行自然越冬和人工模擬低溫脅迫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)越冬期間枝條的脯氨酸含量、可溶性多糖含量、生長(zhǎng)期葉片膜透性(相對(duì)電導(dǎo)率)可以作為牡丹抗寒性的參考指標(biāo)。

以3個(gè)芍藥品種的地下芽與根為試材，筆者測(cè)定了不同低溫條件下它們的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛等生理指標(biāo)，利用主成分分析和隸屬函數(shù)法對(duì)3個(gè)芍藥品種的抗寒性進(jìn)行排序和科學(xué)評(píng)價(jià)，為寒冷地區(qū)引種和生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 選用北京市小湯山國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心苗圃自2009年引種栽培以來生長(zhǎng)正常的3個(gè)芍藥品種，即‘粉玉奴’、‘Monsieur Jules Elie’和‘Pink Hawaiian Coral’。在2011年10月，將已去除地上部分的各品種芍藥從原苗圃中挖出并清洗、分株，每株有5～8個(gè)強(qiáng)壯的地下芽，并將根修剪至15～20 cm長(zhǎng)，去除小根、爛根等。選擇生長(zhǎng)一致的芍藥，每個(gè)品種30株，種植于小湯山苗圃的同一地塊中，種植深度(坑深)在25～30 cm間。各植株在自然條件下冷藏至12月中旬(日平均氣溫穩(wěn)定在0℃左右)。每個(gè)品種隨機(jī)選擇9株，且小心挖出，從每株芍藥上采集3個(gè)地下芽(自芽的根部切下)，另外自根尖起切取最大直徑在1.5 cm左右、長(zhǎng)5 cm的根，每株采取3條根，采后用錫箔紙分別包封好，立即回到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。用流水將地下芽和根沖洗干凈后，再用去離子水漂洗3遍，并用濾紙吸干水分。每個(gè)品種隨機(jī)選擇21個(gè)地下芽和21條根，將各品種的試驗(yàn)材料均分成7份后分別放入自封塑料袋中進(jìn)行不同溫度的低溫脅迫處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法 降溫儀器選擇奧地利SY-LAB公司生產(chǎn)的IceCube 14S型號(hào)程控降溫儀。以儀器內(nèi)部溫度4℃為起始，將試驗(yàn)材料放入儀器。以0.02℃/min的速度下降，下降到0℃后保持5 h，然后每個(gè)品種取出1份;仍以0.02℃/min的速度降溫，下降到－6℃后保持5 h;每個(gè)品種再各取出1份，以此類推。試驗(yàn)設(shè)置處理溫度梯度為0、－6、－12、－18、－24、－30、－36 ℃。在取出的試驗(yàn)材料中，將各品種的地下芽分別放入4℃冰箱中解凍8 h后再取出，用于測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率;將根貯藏于液氮中，用于測(cè)定丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、SOD活性。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與計(jì)算

1.3.1 地下芽的質(zhì)膜相對(duì)透性測(cè)定。質(zhì)膜相對(duì)透性一般采用電導(dǎo)率法測(cè)定。電導(dǎo)率法作為鑒定植物抗寒性的主要方法之一，其用于根系測(cè)定時(shí)誤差往往較大［4］。芍藥不同于同科的牡丹等木本植物，在自然環(huán)境下越冬時(shí)只存留肉質(zhì)根和地下芽?jī)刹糠?。芍藥的地下芽與其第2年的生長(zhǎng)息息相關(guān)，并且受年齡、切片厚度等的影響較小。因此，該試驗(yàn)采用地下芽進(jìn)行相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定。

從4℃冰箱中取出各芍藥品種的地下芽，分別將芽層層剝開，棄掉芽根部的附屬物和最外層鱗片，用濾紙擦干、切碎混勻后測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率［5］。

1.3.2 根的生理指標(biāo)測(cè)定。芍藥根的丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)顯色法測(cè)定;可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定;脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測(cè)定;超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定［5－6］。

1.4 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS18.0軟件進(jìn)行3個(gè)芍藥品種抗寒生理指標(biāo)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、各品種間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的計(jì)算以及各指標(biāo)的相關(guān)性分析、主成分分析。利用隸屬函數(shù)法對(duì)3個(gè)芍藥品種的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下地下芽的相對(duì)電導(dǎo)率變化 由表1可知，隨著溫度的下降，除了‘Pink Hawaiian Coral’地下芽的相對(duì)電導(dǎo)率以－6℃為轉(zhuǎn)折點(diǎn)呈現(xiàn)先小幅下降再升高，其他2個(gè)品種的相對(duì)電導(dǎo)率都一直呈升高的趨勢(shì)，并且從低溫脅迫開始，各品種的相對(duì)電導(dǎo)率變化逐漸加快，而隨著溫度的進(jìn)一步降低，相對(duì)電導(dǎo)率的變化逐漸變緩，差異也逐漸不顯著。這與絕大多數(shù)植物在低溫脅迫條件下相對(duì)電導(dǎo)率所呈現(xiàn)的“S”型曲線趨于一致。

表1 低溫脅迫下3個(gè)芍藥品種地下芽的相對(duì)電導(dǎo)率%

2.2 低溫脅迫下根的生理變化 丙二醛作為細(xì)胞膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，被認(rèn)為可以反映植物在冷應(yīng)激條件下的生理狀態(tài)。由圖1可知，隨著溫度的下降，‘粉玉奴’與‘Pink Hawaiian Coral’丙二醛含量都呈先增加再減少然后增加的變化趨勢(shì)，而‘Monsieur Jules Elie’則呈現(xiàn)“M”型的雙峰現(xiàn)象。除‘Monsieur Jules Elie’的丙二醛含量在－24℃達(dá)到最高值外，其他2個(gè)品種則都在－36℃達(dá)到峰值。

由圖2可知，隨著溫度的下降，3個(gè)芍藥品種根的可溶性糖含量變化較復(fù)雜，但是總體上都呈增加的趨勢(shì)?？扇苄蕴堑姆e累對(duì)植物抗寒有重要作用，由此可知‘Monsieur Jules Elie’的抗寒能力相對(duì)較強(qiáng)。

脯氨酸的積累有助于增強(qiáng)植物的抗性。由圖3可知，3個(gè)芍藥品種根的脯氨酸含量在0～－18℃的降溫過程中都有所下降。隨著溫度下降到－30～－36℃，除‘Pink Hawaiian Coral’外，其他2個(gè)品種的脯氨酸含量都有所上升，但與0℃時(shí)相比仍然較低。

由圖4可知，‘Monsieur Jules Elie’可溶性蛋白含量以－6℃為轉(zhuǎn)折點(diǎn)呈現(xiàn)出先減少再增加的趨勢(shì)，‘粉玉奴’和‘Pink Hawaiian Coral’的可溶性蛋白含量則隨溫度的下降呈先升高再降低然后升高的趨勢(shì)。盡管3個(gè)品種的可溶性蛋白含量變化表現(xiàn)不一，但經(jīng)過低溫脅迫后均有所增加。

超氧化物歧化酶一直被認(rèn)為是植物保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的主要抗氧化劑之一，其活性的提高可以減少逆境對(duì)植物的傷害。由圖5可知，3個(gè)芍藥品種根的超氧化物歧化酶活性均隨著溫度的下降而呈先升高再降低然后升高的趨勢(shì)，并且均在－12℃達(dá)到各自的超氧化物歧化酶活性最高值。

2.3 不同芍藥品種的抗寒性綜合評(píng)價(jià) 一些研究已經(jīng)證實(shí)，相對(duì)電導(dǎo)率與植物的抗寒性呈相關(guān)性。當(dāng)植物在經(jīng)受低溫脅迫時(shí)，植物的抗寒性越差，其相對(duì)電導(dǎo)率越高［8－10］。因此，首先通過對(duì)不同低溫下6個(gè)抗寒指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行分析，再將與相對(duì)電導(dǎo)率在0.05水平和0.01水平相關(guān)的指標(biāo)提取出來用于主成分分析，最后利用隸屬函數(shù)法對(duì)3個(gè)芍藥品種的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2.3.1 抗寒指標(biāo)的相關(guān)性分析。對(duì)3個(gè)芍藥品種的各項(xiàng)抗寒生理指標(biāo)進(jìn)行簡(jiǎn)單相關(guān)分析。由表2可知，相對(duì)電導(dǎo)率與丙二醛含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均呈顯著正相關(guān)(P≤0.01)，與脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性則呈顯著負(fù)相關(guān)(P≤0.01);其他指標(biāo)間也呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。由此可見，各指標(biāo)間所提供的信息會(huì)有一定的重疊和疏漏，用多個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行抗寒性綜合評(píng)價(jià)是必要的。

表2 3個(gè)芍藥品種的抗寒指標(biāo)相關(guān)性分析

2.3.2 抗寒指標(biāo)權(quán)重的確定。根據(jù)相關(guān)性分析的結(jié)果，對(duì)與相對(duì)電導(dǎo)率極顯著相關(guān)的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性5個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。根據(jù)表3中各指標(biāo)的貢獻(xiàn)率確定權(quán)重，結(jié)果見表4。

表3 3個(gè)芍藥品種抗寒性指標(biāo)的特征根及相應(yīng)貢獻(xiàn)率

2.3.3 抗寒指標(biāo)的隸屬度及綜合指數(shù)值。根據(jù)3個(gè)芍藥品種抗寒性相關(guān)指標(biāo)的隸屬度值(表5)，再對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行合成，計(jì)算出3個(gè)芍藥品種的抗寒性綜合指數(shù)(表6)。根據(jù)表中抗寒性綜合指數(shù)的大小，得出3個(gè)芍藥品種的抗寒性強(qiáng)弱排序?yàn)椤甅onsieur Jules Elie’＞‘粉玉奴’＞‘Pink Hawaiian Coral’。

表4 3個(gè)芍藥品種抗寒性指標(biāo)的負(fù)荷量和權(quán)重

3 結(jié)論與討論

研究表明，低溫脅迫引發(fā)了芍藥體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)。以3個(gè)芍藥品種地下芽的相對(duì)電導(dǎo)率與根的5個(gè)生理指標(biāo)之間的相關(guān)性為基礎(chǔ)，通過提取相關(guān)性較強(qiáng)的指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)合隸屬函數(shù)法，最終對(duì)3個(gè)芍藥品種的抗寒性進(jìn)行比較。根據(jù)綜合指數(shù)，可知‘Monsieur Jules Elie’抗寒性最強(qiáng)，‘粉玉奴’次之，‘Pink Hawaiian Coral’最弱。

表5 3個(gè)芍藥品種抗寒性指標(biāo)的隸屬度值

‘Pink Hawaiian Coral’地下芽的相對(duì)電導(dǎo)率從0℃到－30℃幾乎始終與其他2個(gè)品種有顯著差異(P≤0.05)，并且在－24℃時(shí)率先達(dá)到50%，可以推測(cè)其抗寒能力比其他2個(gè)品種更弱。在冷馴化過程中一些植物相容性物質(zhì)的積累被認(rèn)為是其自身的一個(gè)低溫保護(hù)機(jī)制［11－12］。丙二醛、可溶性碳水化合物、蛋白質(zhì)和游離脯氨酸可能參與降低細(xì)胞液冰點(diǎn)、預(yù)防由凍害引發(fā)細(xì)胞脫水所造成的質(zhì)壁分離等活動(dòng)［13－14］。研究還表明，3個(gè)芍藥品種根的可溶性糖含量和可溶性蛋白含量隨著溫度的降低大致呈增加趨勢(shì)，其中各芍藥品種根的可溶性蛋白含量變化不一致。這與任麗［15］對(duì)4個(gè)牡丹品種根的研究結(jié)果相一致，說明芍藥屬植物肉質(zhì)根的可溶性蛋白含量隨溫度降低的變化規(guī)律不明顯。脯氨酸含量則與大部分植物抗寒性結(jié)果不同。研究表明，脯氨酸含量與植物體內(nèi)溶液的滲透勢(shì)密切相關(guān)［16］。額外產(chǎn)生的脯氨酸可以提高植物的抗?jié)B透脅迫［17］，但滲透調(diào)節(jié)并不只依賴一種物質(zhì)完成。除了脯氨酸，它還可能涉及其他有機(jī)相容物質(zhì)和諸如K+一類的無(wú)機(jī)離子［18］。與在植物體的其他器官作用相比，該機(jī)制在根的作用更加復(fù)雜。艾琳等［19］就發(fā)現(xiàn)5個(gè)葡萄品種根系的脯氨酸含量隨溫度的降低而下降。芍藥具有變態(tài)的肉質(zhì)根，從0℃至－18℃的各芍藥品種根的脯氨酸含量下降很可能是由各種原因綜合造成的。由于迄今為止人們對(duì)芍藥根的生理生化研究較少，這種現(xiàn)象的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。一般認(rèn)為，通過增加SOD活性可以加強(qiáng)保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用。試驗(yàn)中的‘Pink Hawaiian Coral’和‘粉玉奴’的SOD活性一直較低，可以推測(cè)出二者的抗氧化系統(tǒng)較弱，抵御脅迫能力較差。

表6 3個(gè)芍藥品種抗寒性綜合指數(shù)和排名

前人的研究結(jié)果表明，從國(guó)外引種的芍藥切花品種(包括試驗(yàn)中的‘Monsieur Jules Elie’和‘Pink Hawaiian Coral’)在北京的氣候條件下均可以正常生長(zhǎng)、開花，并且保持較高的觀賞價(jià)值［20－21］。孫菊芳等［22］從美國(guó)引種栽培 13個(gè)芍藥與牡丹的組間雜種，發(fā)現(xiàn)它們可以在北京的氣候條件下正常生長(zhǎng)。但是，研究中作為組內(nèi)亞組間雜種后代品種的‘Pink Hawaiian Coral’是3個(gè)品種中抗寒性最差的，其親本為Paeonia lactiflora‘Charlie＇s White’× P.peregrina‘Otto Froebel’，其中P.peregrina主要分布于歐洲東部和土耳其，比中國(guó)芍藥分布的氣候帶偏南。這可能是其雜交后代不如中國(guó)芍藥品種群耐寒的原因之一。另外，盡管雜種優(yōu)勢(shì)是影響植物抗性的一個(gè)重要因素，但抗寒性還與植物遺傳性、環(huán)境作用、植物株齡等多種因素有關(guān)。

［1］金研銘，徐惠風(fēng)，李亞東，等.牡丹引種及其抗寒性的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21(2):37 －39.

［2］岳樺，李欣，任麗，等.不同紫斑牡丹品種抗寒性差異分析［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37(5):62 －63.

［3］鞠志新.東北地區(qū)牡丹生態(tài)適應(yīng)性及抗寒性研究［D］.北京:北京林業(yè)大學(xué)，2011.

［4］李丙智，文建雷，張建平，等.電導(dǎo)法測(cè)定葡萄根系抗寒性方法的探討［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，8(3):105 －108.

［5］孔祥生，易現(xiàn)峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

［6］李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2000.

［7］王琪，于曉南.3種彩葉樹對(duì)低溫的生理響應(yīng)及抗寒性評(píng)價(jià)［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(5):104 －109.

［8］董麗，黃亦工，賈麥娥，等.北京園林主要常綠闊葉植物抗凍性及其測(cè)定方法［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24(3):70 －73.

［9］崔紅，于晶，高秀芹，等.3個(gè)紫斑牡丹品種的抗寒生理特性研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，40(7):24 －27.

［10］趙雪梅，成仿云，唐立紅，等.赤峰地區(qū)紫斑牡丹的引種與抗寒性研究［J］.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(2):84 －90.

［11］ALBERDI M，CORCUERA L J.Cold acclimation in plants［J］.Phytochemistry，1991，30:3177 －3184.

［12］LIVINGSTON D P.The second phase of cold hardening:freezing tolerance and fructan isomer changes in winter cereal crowns［J］.Crop science，1996，36:1568 －1573.

［13］SAKAI A，LARCHER W.Frost survival of plants:Responses and adaptation to freezing stress［M］.Berlin:Springer Verlag，1987.

［14］SANTARIUS K A.Freezing of isolated thylakoid membranes in complex media.VIII.Differential cryoprotection by sucrose，proline and glycerol［J］.Physiologia plantarum，1992，84:87 －93.

［15］任麗.十種中原牡丹引種哈爾濱地區(qū)抗寒性研究［D］.哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)，2009.

［16］CHU T M，ASPINALL D，PALEG L G.Stress metabolism.Ⅵ.Temperature stress and the accumulation of proline in barley and radish［J］.Australian journal of plant physiology，1973，26:319 －327.

［17］KAVI K P B，HONG Z，MIAO G H，et al.Overexpression of 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants［J］.Plant physiology，1995，108:1387 －1394.

［18］王寶山，趙可夫，鄒琦.作物耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展及提高作物抗鹽性的對(duì)策［J］.植物學(xué)通報(bào)，1997，14(S1):25 －30.

［19］艾琳，張萍，胡志成.低溫脅迫對(duì)葡萄根系膜系統(tǒng)和可溶性糖及脯氨酸含量的影響［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(4):47 －50.

［20］姚苗笛.芍藥切花品種引種及繁殖研究［D］.北京:北京林業(yè)大學(xué)，2009.

［21］于曉南，宋煥芝，王琪.北美新芍藥品種引種適應(yīng)性初報(bào)［J］.林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2011(12):50－51.

［22］孫菊芳，成仿云.芍藥與牡丹組間雜種引種栽培初報(bào)［J］.中國(guó)園林，2007(5):51－54.