耿丹丹，譚 亮，肖遠(yuǎn)燦，胡風(fēng)祖，董 琦,*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049）

離子色譜法測定黑果枸杞中的甜菜堿

耿丹丹1,2，譚 亮1，肖遠(yuǎn)燦1，胡風(fēng)祖1，董 琦1,*

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049）

建立黑果枸杞中甜菜堿的離子色譜測定法。采用Metrosep C4陽離子分析柱（150 mm×4.6 mm，4 μm），柱溫為38.5 ℃，1.5 mmol/L甲烷磺酸溶液為流動相，流速為0.8 mL/min，電導(dǎo)檢測器。結(jié)果表明，甜菜堿在10.4～830.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.999 8），加標(biāo)回收率在95.51%～98.06%（n=3）之間。所建方法操作簡便、重復(fù)性好，適用于黑果枸杞中甜菜堿含量測定。

離子色譜；黑果枸杞；甜菜堿

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）多年生灌木，分布于我國陜西北部黃土高原、寧夏、甘肅、青海、內(nèi)蒙古、新疆和西藏等地區(qū)，中亞、高加索和歐洲等地區(qū)亦有分布[1]?！毒е楸静荨?、《四部醫(yī)典》記載，藏醫(yī)以其成熟果實入藥，治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等病癥，并且藥效明顯，民間用作滋補強壯、明目及降壓藥[2-3]。甜菜堿是黑果枸杞中主要藥效成分之一，在體內(nèi)起甲基供體的作用，具有抗脂肪肝、降壓、抗腫瘤等作用[4-5]。

甜菜堿是一種季銨型生物堿，具有良好的理化性狀和較好的穩(wěn)定性及抗氧化能力。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與氨基酸、膽堿相似具有多種生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、醫(yī)藥工業(yè)、農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、食品添加劑、日化等領(lǐng)域[6-10]。目前測定甜菜堿含量的方法包括：酸堿滴定法、凱氏定氮法、紫外分光光度法、高氯酸非水滴定法、高效液相色譜法、離子色譜法等。楊雪等[11]比較了甜菜堿含量的測定方法，發(fā)現(xiàn)離子色譜法測定甜菜堿含量更準(zhǔn)確、更方便。離子色譜法在檢測甜菜堿方法中有著令人滿意的結(jié)果，顯示出良好的應(yīng)用前景[12-18]。

目前，采用離子色譜法測定黑果枸杞中甜菜堿含量尚未見報道。本實驗建立了離子色譜法測定黑果枸杞甜菜堿的含量，該方法操作簡單、重復(fù)性和準(zhǔn)確性好、成本低[11,17]，對黑果枸杞的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了一定方法支撐，為黑果枸杞資源的研究與開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

收集不同產(chǎn)地的7 批黑果枸杞樣品，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所馬世震副研究員鑒定為黑果枸杞。將新鮮黑果枸杞通風(fēng)處陰干，粉碎后置干燥器中保存。樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table1 Information about the samples used in this study

甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品（供含量測定用） 中國食品藥品檢定研究院；甲磺酸（純度不小于98%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氯甲烷和正丁醇均為分析純；超純水（電阻率不小于18.2Ω·M）實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

930系列智能集成型離子色譜儀（配備930 Compact IC Flex蠕動泵，945 Professional Detector Vario電導(dǎo)檢測器） 瑞士Metrohm公司；TGL-16C型高速臺式離心機上海安亭科學(xué)儀器廠；AG135型精密電子天平 瑞士MettlerToledo公司；KQ-100E型超聲波清洗器 昆山超聲儀器科技公司；優(yōu)普UPE-Ⅱ-40L型超純水機 上海優(yōu)普實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

淋洗液：準(zhǔn)確稱取甲磺酸2.88 g，置于1 000 mL容量瓶中，加純水稀釋至刻度，搖勻，配制成30 mmol/L甲磺酸溶液。準(zhǔn)確吸取50 mL該溶液，加純水定容至1 000 mL，搖勻。0.45 μm濾膜過濾，備用。

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：準(zhǔn)確稱取甜菜堿對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度0.83 mg/mL甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置于4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 色譜條件

淋洗液：甲磺酸溶液；色譜柱：Metrosep C4陽離子分析柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；檢測器：電導(dǎo)檢測器；流速：0.8 mL/min；柱溫：38.5 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.3 樣品前處理

稱取枸杞樣品粉末約3 g，精密稱定（準(zhǔn)確至0.001 g），置于具塞三角瓶中，加入80 mL水，超聲提取30 min，過濾至100 mL容量瓶中，靜置10 min，定容至刻度，搖勻。取2 mL濾液于離心管中，加入2 mL Sevag試劑[17-19]（三氯甲烷-正丁醇，4∶1，V/V），劇烈振蕩使其充分混合，在9 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心5 min，棄去中間變性蛋白層和下層有機層，上層水相繼續(xù)重復(fù)上述操作直至水相與有機相中間無變性蛋白出現(xiàn)為止。移取上層清液，過0.45 μm濾膜后測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法選擇

在利用離子色譜法對黑果枸杞樣品中甜菜堿的測定時，起干擾作用的雜質(zhì)主要有花青素和蛋白質(zhì)。色素和蛋白質(zhì)過多會對離子色譜柱造成嚴(yán)重?fù)p害，因此實驗過程中必須進(jìn)行脫色以及除蛋白質(zhì)處理。比較Sevag法[19-21]及三氯甲烷除蛋白方法[22]：分別于5 mL離心管中加入2 mL三氯甲烷溶液和Sevag試劑，然后加入2 mL黑果枸杞樣品溶液，劇烈振蕩后離心，取上層清液對比溶液顏色變化。結(jié)果可知，利用Sevag試劑處理過的樣品溶液顏色明顯淺于三氯甲烷處理后的樣品溶液，且色譜圖中目標(biāo)峰處雜質(zhì)干擾明顯降低。所以，本實驗采用Sevag試劑作為樣品前處理溶劑。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測方式的選擇

由于甜菜堿是一種季銨型生物堿，在酸性條件下，可以電離成陽離子，在電導(dǎo)檢測器條件下有電導(dǎo)響應(yīng)。因此，選擇電導(dǎo)檢測器作為檢測方式。

2.2.2 色譜條件的優(yōu)化

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of betaine standard (a) and betaine sample from Lycium ruthenicum Murr. (b)

為了排除樣品中除甜菜堿之外的其他陽離子干擾，選擇陽離子分析常用的淋洗強度較強的甲磺酸溶液作為淋洗液[23-25]?？疾炝芟匆旱臐舛?、流速對甜菜堿色譜峰的影響，發(fā)現(xiàn)提高淋洗液的濃度時，保留較弱的甜菜堿與干擾離子不能完全分離，最終確定甲磺酸淋洗液濃度為1.5 mmol/L，流速為0.8 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品色譜圖分別見圖1a和圖1b。

2.3 線性關(guān)系和重復(fù)性

以峰面積為縱坐標(biāo)對甜菜堿質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果得回歸方程為y=0.004 4x－0.021 5（R2=0.999 8），甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在10.4～830.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

對方法的重復(fù)性進(jìn)行考察，分別稱取6 份黑果枸杞樣品約3 g，精密稱定（準(zhǔn)確至0.001 g），按1.3.3節(jié)處理，1.3.2節(jié)測定峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果顯示，樣品中甜菜堿峰面積的RSD為3.25%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.4 檢出限和定量限

采用逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液的方法確定檢出限和定量限，得到甜菜堿的檢出限和定量限分別為60 mg/kg和200 mg/kg。

2.5 回收率

采用加樣回收法，在9 份已知甜菜堿含量的樣品中按低、中、高質(zhì)量濃度分別精密加入甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一質(zhì)量濃度3 份，并按1.3.3節(jié)處理，1.3.2節(jié)測定峰面積，計算平均回收率和RSD，測定結(jié)果見表2。加標(biāo)回收率落在95.51%～98.06%之間，RSD均小于1.14%。

表2 加標(biāo)回收率及RSD（n =3）Table2 Recovery and RSD in spiked samples (n = 3)

2.6 樣品的含量檢測結(jié)果

根據(jù)實驗選定的方法，對7 批不同產(chǎn)地的黑果枸杞樣品進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見表3。甘肅民勤縣黑果枸杞中甜菜堿含量最高為19.58 mg/g，青海格爾木市最低為9.44 mg/g。

表3 樣品分析結(jié)果（n=3）Table3 Betaine contents of real samples (n = 3)

3 結(jié) 論

本實驗建立離子色譜法檢測黑果枸杞中甜菜堿的方法，并對新疆、青海、甘肅3 地7 批不同產(chǎn)地的黑果枸杞中甜菜堿進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡單。本研究結(jié)果可為黑果枸杞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

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Determination of Betaine in Lycium ruthenicum Murr. by Ion Chromatography

GENG Dandan1,2, TAN Liang1, XIAO Yuancan1, HU Fengzu1, DONG Qi1,*
(1. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810008, China; 2. College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

An ion chromatography coupled with conductivity detection method was developed for the determination of betaine in Lycium ruthenicum Murr.. The analyte was separated on a Metrosep C4cation exchange column (150 mm × 4.6 mm, 4 μm) by using methane sulfonic acid (1.5 mmol/L) as mobile phase. The fl ow rate was 0.8 mL/min at a column temperature of 38.5 ℃. It was found that the linearity range of betaine was 10.4-830.0 mg/L (R2= 0.999 8) and the spiked recoveries varied in the range of 95.51%-98.06%. The proposed method was found to be simple, reproducible and suitable for the determination of betaine in L. ruthenicum.

ion chromatography; Lycium ruthenicum Murr.; betaine

O657.75

A

1002-6630（2015）20-0145-03

10.7506/spkx1002-6630-201520027

2015-01-21

中國科學(xué)院儀器功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目（Ig201308）

耿丹丹（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物與藥物分析。E-mail：gengdandan110@163.com

*通信作者：董琦（1980—），女，工程師，碩士，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：qdong@nwipb.cas.cn