姚 曦，岳永德，湯 鋒

（國際竹藤中心，北京 100102）

高效液相色譜法同時測定8 種叢生竹竹葉中香豆素類成分

姚 曦，岳永德，湯 鋒

（國際竹藤中心，北京 100102）

竹葉用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇為提取溶劑進行快速微波輔助萃取，采用高效液相色譜法測定樣品中10 種香豆素類化學(xué)成分（茵芋苷、東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、傘形酮、6,7-二甲氧基香豆素、香豆素、補骨脂素、花椒毒素、5,7-二甲氧基香豆素、茴芹內(nèi)酯）。標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)5 次進樣和在3 d內(nèi)多次進樣，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于3.47%。對2 屬8 個叢生竹竹種（梁山慈竹、牡竹、龍竹、勃氏甜龍竹、硬頭黃竹、黃金間碧玉竹、粉單竹和青皮竹）竹葉樣品分析，共檢出5 種香豆素類化合物，含量在2.07～67.54 mg/kg之間。黃金間碧竹中總香豆素含量最高，為103.77 mg/kg，梁山慈竹中總香豆素含量最低，為27.32 mg/kg。簕竹屬組的4 種竹葉香豆素總體含量水平明顯高于牡竹屬組。

叢生竹；竹葉；香豆素；高效液相色譜

中國竹類資源豐富，栽培利用歷史悠久。隨著現(xiàn)代研究的深入，竹葉中多種有效成分，如黃酮及其苷類[1-3]、多糖[4]、揮發(fā)油[5-6]、酚酸類[7-8]、礦質(zhì)元素[9]等多種類型天然活性物質(zhì)，不斷被重新發(fā)掘認(rèn)識并加以利用[10-11]。香豆素及其衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、香料等領(lǐng)域當(dāng)中[12]，天然香豆素特有的生物學(xué)和生理學(xué)性質(zhì)，如抗炎抑菌、降壓、抗心律失常、抗骨質(zhì)疏松等，特別是某些種類香豆素具有的抗腫瘤和抗HIV活性[13]，引起了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。目前，從化學(xué)利用角度，毛竹等散生竹種研究較多，而叢生竹報道較少。近來本課題組從簕竹屬中的撐篙竹（Bambusa Pervariabilis McClure）竹葉中發(fā)現(xiàn)了3 種香豆素類成分[14]，引起了一定關(guān)注。

目前，氣相色譜法[15]、高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法[16-18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20]和毛細(xì)管電泳法[21]等是測定植物樣品中香豆素成分的主要分析方法，其中以HPLC法較為準(zhǔn)確、快捷。本研究選取我國栽培面積廣、生物量大的梁山慈竹等2 個竹屬共8 種重要的叢生竹竹種，采用密閉微波輻射法提取，HPLC檢測，對竹葉中香豆素類成分進行分析比較，以期挖掘叢生竹資源在食品和日化領(lǐng)域的利用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）、硬頭黃竹（Bambusa rigida）、黃金間碧竹（Bambusa vulgaris）、青皮竹（Bambusa textilis）、粉單竹（Bambusa chungii）竹葉樣品于2010年10月采自四川長寧世紀(jì)竹種園；牡竹（Dendrocalamus strictus）、龍竹（Dendrocalamus giganteus）、勃氏甜龍竹（Dendrocalamus brandisii）竹葉樣品于2010年10月采自中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園。竹葉自然陰干，粉碎后過60 目篩，于冰柜（－20 ℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

東莨菪內(nèi)酯、香豆素（純度≥98%） 美國百靈威科技有限公司；補骨脂素、東莨菪苷、花椒毒素、傘形酮、6,7-二甲氧基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、茵芋苷、茴芹內(nèi)酯（純度≥97%） 云南西力生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS-5型微波消解儀 美國CEM公司；2695型HPLC儀（具2996二極管陣列檢測器和2487紫外檢測器）美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用XTerra MS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相為乙腈-0.5%磷酸，梯度洗脫（表1）；檢測波長316 nm；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

表1 流動相梯度洗脫方法Table1 Gradient elution program

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取茵芋苷、東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、傘形酮、6,7-二甲氧基香豆素、香豆素、補骨脂素、花椒毒素、5,7-二甲氧基香豆 素、茴芹內(nèi)酯10 種標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，分別置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解定容，得到質(zhì)量濃度500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，備用。準(zhǔn)確吸取0.5 mL茵芋苷、東莨菪內(nèi)酯、6,7-二甲氧基香豆素、香豆素、補骨脂素、花椒毒素、5,7-二甲氧基香豆素、茴芹內(nèi)酯8 種儲備液于10 mL容量瓶中，再分別取0.75 mL東莨菪苷及0.25 mL傘形酮于加入，以甲醇定容至刻度，得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)需要將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液再稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃條件下避光保存。

1.3.3 樣品溶液的制備[22-23]

分別稱取8 個竹種竹葉樣品1.2 g，置于微波消解罐中，加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液30 mL，微 波提取2 次，每次10 min，設(shè)定微波功率400 W，溫度70 ℃，合并2 次濾液，減壓濃縮至近干，殘渣用甲醇溶解，定容到50 mL。準(zhǔn)確吸取上述溶液1.0 mL置于5 mL容量瓶中，甲醇定容。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，HPLC待測。各樣品重復(fù)3 次。

1.3.4 精密度及標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性實驗

取對照標(biāo)準(zhǔn)品的一個質(zhì)量濃度，連續(xù)5 次進樣，并在3 d內(nèi)多次進樣，選0、2、4、8、12 h，1、2、3 d共8 個點的分析結(jié)果，計算各標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 添加回收實驗

參照文獻[24-25]的方法進行添加回收實驗，計算回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖1 10 種混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixture of 10 coumarin standards

在設(shè)定的色譜條件下，香豆素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。 10 種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間先后順序為茵芋苷、東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、傘形酮、6,7-二甲氧基香豆素、香豆素、補骨脂素、花椒毒素、5,7-二甲氧基香豆素、茴芹內(nèi)酯。

按1.3.1節(jié)色譜條件進樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到相應(yīng)的回歸方程及相關(guān)系數(shù)（表2）。10 種標(biāo)準(zhǔn)品在所選定的色譜條件下和質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，分離較好，線性關(guān)系良好。

表2 10 種混合標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table2 Regression equation with correlation coeffi cients of ten coumarine standards

2.2 精密度及標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性

取對照標(biāo)準(zhǔn)品的一個質(zhì)量濃度連續(xù)進樣5 次，在3 d內(nèi)不同時間共8 次進樣，對其峰面積進行統(tǒng)計分析，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（表3）。用來表示精密度及日內(nèi)穩(wěn)定性的10種標(biāo)準(zhǔn)品峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最高值為1.84%，說明儀器條件穩(wěn)定且精密度高。除6,7-二甲氧基香豆素外（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.47%），其他9 種標(biāo)準(zhǔn)品在3 d內(nèi)穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.38%～2.85%之間。

表3 10 種標(biāo)準(zhǔn)品的不同進樣時間峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table3 RSDs of the precision and stability of ten coumarins%

2.3 添加回收實驗結(jié)果

表4 10 種香豆素添加回收結(jié)果Table4 Recoveries of ten coumarin compounds

選取梁山慈竹樣品，加入一定量的各標(biāo)準(zhǔn)品香豆素。10 種香豆素的添加回收結(jié)果見表4。在所選擇的分析條件下，6,7-二甲氧基香豆素的回收率略低，為64.5%，其余9 種標(biāo)準(zhǔn)品的樣品添加回收率均高于70%，在83.2%～108.1%之間，滿足實驗要求，方法穩(wěn)定，結(jié)果可靠。

2.4 樣品測定結(jié)果

表5 8 種叢生竹竹葉香豆素類化合物含量Table5 The contents of coumarins in th e leaves of eight sympodial bamboo species mg/kg

按1.3.3節(jié)處理 樣品和1.3.1節(jié)所設(shè)定的色譜條件，對包括梁山慈竹等8 種叢生竹竹葉所含香豆素進行測定。由表5可知，8 種竹葉中共檢出5 種香豆素類物質(zhì)，為東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、傘形酮、香豆素、茴芹內(nèi)酯，其中粉單竹竹葉中均有檢出上述香豆素類成分，所有8 種竹葉樣品中均檢出了東莨菪內(nèi)酯和香豆素。

東莨菪苷在檢出的5 種香豆素含量中水平較高，黃金間碧竹的東莨菪苷含量最高，與其他竹種差異顯著（P＜0.05），達到了67.54 mg/kg；粉單竹東莨菪內(nèi)酯含量最高且與其他竹種差異顯著（P＜0.05），為37.84 mg/kg，牡竹含量最低，為11.26 mg/kg；傘形酮存在于牡竹、粉單竹和青皮竹竹葉中且含量較低，分別為2.07、4.19 mg/kg和2.65 mg/kg；各竹種香豆素含量較為接近，為10 mg/kg量級，最高為牡竹的15.37 mg/kg；茴芹內(nèi)酯僅在梁山慈竹和粉單竹中發(fā)現(xiàn)，含量較低差異不顯著，分別為2.11 mg/kg和2.45 mg/kg?？傁愣顾睾孔罡邽辄S金間碧竹，達到了103.77 mg/kg，其次是粉單竹，也有99.1 mg/kg，最低為梁山慈竹，總含量僅為27.32 mg/kg。

其余茵芋苷、6,7-二甲氧基香豆素、補骨脂素、花椒毒素、5,7-二甲氧基香豆素成分在8 種叢生竹竹葉中均未檢出。

3 結(jié) 論

微波輔助提取可有效提高植物活性組分的提取效率，且雜質(zhì)少[26]。本研究利用連續(xù)微波照射，應(yīng)用HPLC技術(shù)較好地實現(xiàn)了竹葉中香豆素類化合物有效、快速的提取。分析顯示8 種叢生竹中均含有東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯、傘形酮、香豆素、茴芹內(nèi)酯5 種香豆素類化合物，含量在2.07～67.54 mg/kg之間，其中黃金間碧竹東莨菪苷含量最高，且黃金間碧竹中總香豆素含量較為突出，為103.77 mg/kg，可進一步加強研究。從分類上看，梁山慈竹、牡竹、龍竹、勃氏甜龍竹同屬于牡竹屬，硬頭黃竹、黃金間碧竹、粉單竹和青皮竹同屬于簕竹屬，本研究結(jié)果表明，簕竹屬組的4 種竹葉香豆素總體含量水平明顯高于牡竹屬組。竹類植物種類多、生長快、生物量巨大，次生代謝物豐富，是開發(fā)天然活性產(chǎn)物的理想材料，本研究結(jié)果對于叢生竹資源的進一步高附加值利用提供參考。

[1] 張英. 天然功能性竹葉提取物: 竹葉黃酮[J]. 中國食品添加劑, 2002(3): 54-58.

[2] NAKAJIMA Y, YUN Y S, KUNUGI A. Six new fl avonolignans from Sasa veitchii (Carr.) Rehder[J]. Tetrahedron, 2003, 59(40): 8011-8015.

[3] SULTANA N, NAM-HO L. A new alkene glycoside from the leaves of Sasa quelpaertensis Nakai[J]. Phytochemistry, 2008, 10(9): 903-907.

[4] 姚曦, 岳永德, 湯鋒. 竹葉多糖的研究進展[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2009, 29(6): 93-97.

[5] 周熠, 譚興和, 李清明. 超臨界CO2萃取箬竹葉揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工, 2009(4): 79-82.

[6] 周熠, 譚興和, 李清明. 同時蒸餾萃取箬竹葉揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜分析[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(10): 199-202.

[7] 周慧燕, 章輝, 李士敏. 竹葉化學(xué)成分研究Ⅰ[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(24): 1933-1934.

[8] 周慧燕, 李士敏. 竹葉化學(xué)成分研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(9): 662-663.

[9] 姚曦, 岳永德, 湯鋒. 竹葉中多種無機元素的ICP-MS測定[J]. 林業(yè)科學(xué), 2009, 45(11): 26-31

[10] 岳永德, 操海群, 湯鋒. 竹提取物的化學(xué)成分及其利用研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 34(3): 328-333.

[11] 王淑英, 湯鋒, 岳永德. 竹類植物的化學(xué)成分及藥理活性研究進展[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2013, 33(3): 149-156.

[12] 韓熠, 張承明, 喻坤. 食品及化妝品中香豆素和黃樟素類化合物分析方法研究進展[J]. 香料香精化妝品, 2013, 20(1): 45-49.

[13] 張韶瑜, 孟林, 高文遠(yuǎn). 香豆素類化合物生物學(xué)活性研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2005, 30(6): 410-415.

[14] SUN Jia, YUE Yongde, TANG Feng, et al. Coumarins from the leaves of Bambusa pevariabilis McClure[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2010, 12(3): 248-251.

[15] VILEGAS J H Y, MARCHIE D E, LANCAS F M. Extraction of lowpolarity compounds (with emphasis on coumarin and kaurenoic acid) from Mikania glomerata (‘guaco’.) leaves[J]. Phytochemical Analysis, 1997, 8(5): 266-270.

[16] 陳二林, 劉小花, 李文, 等. 高效液相色譜法同時測定少毛北前胡中6 種香豆素[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(8): 1227-1231.

[17] 楊英來, 楊濤, 楊玉華. 超高效液相色譜法測定濃縮當(dāng)歸丸和當(dāng)歸藥材中光毒性化合物香豆素[J]. 分析化學(xué), 2013, 41(11): 1744-1748.

[18] 楊春, 程文亮, 梅建風(fēng), 等. 柳葉蠟梅中總香豆素的提取工藝研究及純化[J]. 浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2012, 40(3): 247-249.

[19] AHNM J, LEEM K, KIM Y C, et al. The simultaneous determination of coumarins in Angelica gigas root by high performance liquid chromatography-diode array detector coupled with electrospray ionization/mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 46(2): 258-266.

[20] SU J, ZHANG C, ZHANG W, et al. Qualitative and quantitative determination of the major coumarins in Zushima by high performance liquid chromatography with diode array detector and mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11): 2111-2117.

[21] WANG Weiping, TANG Jianghong, WANG Shumin, et al. Method development for the determination of coumarin compounds by capillary electrophores is with indirect laser-induced fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1148(1): 108-114.

[22] 閆廣平. 微波輔助提取獨活中香豆素類成分的工藝研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 27(24): 104-107.

[23] 藍(lán)長波. MAE-RPHPLC-FLD法測定丁公藤及其制劑中總東莨菪內(nèi)酯含量[J]. 藥物分析雜質(zhì), 2014, 34(12): 2251-2256.

[24] 肖維強, 黃炳雄, 王曉容, 等. HPLC法測定龍眼肉中的幾種核苷類物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1): 9-11.

[25] 戴宏芬, 賴志勇, 李建光, 等. 黃皮和楊梅果肉中綠原酸、表兒茶素及蘆丁含量的HPLC測定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008, 27(3): 445-449.

[26] 李敏晶. 微波輔助萃取中藥有效成分的研究[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2004.

Simultaneous Determination of Coumarins in Leaves of Eight Sympodial Bamboo Species with High Performance Liquid Chromatography

YAO Xi, YUE Yongde, TANG Feng
(International Centre for Bamboo and Rattan, Beijing 100102, China)

Coumarins from the leaves of eight sympodial bamboo species (Dendrocalamus farinosus, Bambusa rigida, Bambusa vulgaris, Bambusa textilis, Bambusa chungii, Dendrocalamus strictu, Dendrocalamus giganteus, and Dendrocalamus brandisii) were extracted with ethanol-water (80:20, V/V) using a microwave-assisted method. A high-performance liquid chromatography (HPLC) method for separating and determining ten coumarin standards including skimin, scopolin, scopoletin, umbelliferone, 6,7-dimethoxycoumarin, coumarin, psoralen, xanthotoxin, 5,7-dimethoxycoumarin, and pimpinellin was developed and used to analyze the coumarins extracted from the leaves of sympodial bamboo. Relative standard deviations (RSD) of peak area were below 3.47% in fi ve consecutive tests and repeated tests during three days. A total of fi ve coumarins were detected at contents ranging from 2.07 to 67.54 mg/kg. The maximum amount of total coumarins was found in Bambusa vulgaris with content of 103.77 mg/kg, while the minimum amount of 27.32 mg/kg was found in Dendrocalamus farinosus. The contents of total coumarins in the leaves of four Bambusa species were obviously higher than in four Dendrocalamus species.

sympodial bamboo; bamboo leaves; coumarins; high performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-6630（2015）20-0105-04

10.7506/spkx1002-6630-201520019

2015-04-10

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD23B03）

姚曦（1981—），男，助理研究員，博士，研究方向為植物化學(xué)與功能性食品。E-mail：yaoxi@icbr.ac.cn