張麗紅 謝三都 徐 芳 林曉燕 高 寧（.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；.福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院，福建 泉州 3633）

紫蘇［Perilla frutescens（L.）Britt.］屬唇形科紫蘇屬，是藥食兩用的一年生草本植物［1－3］。其葉片中含有9種花色素苷及順式異構(gòu)體，其中以丙二?；咸K寧和紫蘇寧最為典型［4－6］。在紫蘇葉多糖提取過(guò)程中，水溶性的花色素苷與多糖一起被提取出來(lái)，導(dǎo)致產(chǎn)品呈現(xiàn)黑紫色或紅紫色，降低了紫蘇葉多糖的純度，不利于進(jìn)一步研究。

目前，有關(guān)植物多糖脫色的方法主要有化學(xué)方法和物理方法兩種?；瘜W(xué)方法一般是通過(guò)化學(xué)物質(zhì)本身所具有的強(qiáng)氧化性破壞色素結(jié)構(gòu)而不呈現(xiàn)顏色達(dá)到脫色目的，如雙氧水［7，8］，但容易造成目標(biāo)物質(zhì)被破壞而產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p失。物理方法是通過(guò)吸附劑對(duì)色素顆粒的吸附作用使其與目標(biāo)物質(zhì)分離而達(dá)到脫色目的，常見(jiàn)的吸附劑有活性炭［9－11］和大孔樹(shù)脂［12－14］。到目前為止，未見(jiàn)有關(guān)紫蘇葉多糖脫色的研究性報(bào)道。

本研究擬以紫蘇葉多糖提取液的脫色率和多糖損失率為指標(biāo)，考察活性炭類(lèi)型、活性炭用量、脫色時(shí)間、脫色溫度、脫色pH對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的影響，并采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化對(duì)各因素進(jìn)行優(yōu)化，提高了紫蘇葉多糖的純度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑紫蘇：2013年7月采摘自南安市碼頭鎮(zhèn)野生紫蘇葉片；粉末活性炭（過(guò)120目標(biāo)準(zhǔn)樣篩）、條形活性炭、椰殼活性炭：福建省南平元力活性炭有限公司；

D（＋）－無(wú)水葡萄糖、檸檬酸、苯酚、濃H2SO4等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV－2802S型，龍尼柯上海儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－8型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE－2000A型，上海亞榮生化儀器廠；

數(shù)顯pH計(jì)：PHS－3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇葉多糖提取液制備流程

新鮮紫蘇葉→預(yù)處理→浸提→過(guò)濾→活性炭處理→過(guò)濾、離心→上清液→產(chǎn)品

1.2.2 脫色率的計(jì)算

（1）紫蘇葉提取液吸收峰的檢測(cè)：將紫蘇葉多糖提取液經(jīng)全波段掃描，設(shè)備參數(shù)：中速掃描、波長(zhǎng)間隔1.0nm、波長(zhǎng)范圍190.0～1 100.0nm。

全波段掃描結(jié)果顯示，在波長(zhǎng)為330nm處有吸收峰，故以該波長(zhǎng)作用檢測(cè)波長(zhǎng)。

（2）脫色率的計(jì)算：根據(jù)式（1）計(jì)算脫色率：

式中：

Y1——紫蘇葉多糖提取液的脫色率，%；

OD0——原樣品在波長(zhǎng)為330nm處的吸光度；

OD1——處理后的樣品在波長(zhǎng)為330nm處的吸光度。

1.2.3 多糖損失率的計(jì)算 采用苯酚—硫酸法［15］測(cè)定樣品中多糖的含量，并按式（2）計(jì)算紫蘇葉多糖損失率：

式中：

Y2——紫蘇葉多糖損失率，%；

m0——原樣品中紫蘇葉多糖含量，g；

m1——處理后樣品中紫蘇葉多糖含量，g。

1.2.4 紫蘇葉多糖提取液活性炭脫色工藝的單因素試驗(yàn)

（1）活性炭類(lèi)型：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）分別添加粉末活性炭、條形活性炭、椰殼活性炭的量均為0.5%，在40℃下脫色20min后過(guò)濾，計(jì)算脫色率和多糖損失率。

（2）活性炭用量：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）分別添加0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%，2.00%的活性炭在40℃下脫色20min后過(guò)濾，計(jì)算脫色率和多糖損失率。

（3）脫色時(shí)間：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）添加0.75%的活性炭在40℃下分別脫色5，10，15，20，25，30min后過(guò)濾，計(jì)算脫色率和多糖損失率。

（4）脫色溫度：紫蘇葉多糖提取液（pH 6.7）添加0.75%的活性炭分別在30，40，50，60，70，80℃下脫色20min后過(guò)濾，計(jì)算脫色率和多糖損失率。

（5）pH值：采用磷酸緩沖液調(diào)整樣品的pH分別為4.5，5.0，5.5，6.0，6.7，7.0，7.5，8.0后添加0.75%的活性炭、在60℃下脫色20min后過(guò)濾，計(jì)算脫色率和多糖損失率。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化活性炭脫色工藝 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以脫色率（Y1）和多糖損失率（Y2）作為響應(yīng)值，根據(jù)BBD中心組合設(shè)計(jì)的原理［16，17］進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，確定活性炭脫色的最優(yōu)條件。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Design－Expert 7.1.3數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)響應(yīng)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合、方差分析、顯著性檢測(cè)、響應(yīng)面分析和工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性炭種類(lèi)對(duì)脫色效果的影響

由圖1可知，采用粉末型活性炭的脫色效果最好：脫色率高、多糖損失少?；钚蕴渴峭ㄟ^(guò)對(duì)色素顆粒的物理性吸附并隨活性炭的去除達(dá)到脫色目的，與條形活性炭和椰殼活性炭比較，粉末活性炭的比表面積（800～2 000m2/g）最大，吸附能力強(qiáng)，具有速度快、脫色率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)［18－21］。因此，本試驗(yàn)采用粉末型活性炭作用為脫色劑。

圖1 不同活性炭種類(lèi)的脫色效果Figure 1 Effect of the types of activated charcoal on the decolorization

2.2 活性炭用量對(duì)脫色效果的影響

由圖2可知，活性炭用量的增加，使得紫蘇葉多糖提取液的脫色率逐漸增加后趨于平穩(wěn)，這是因?yàn)殡S著活性炭用量增加，紫蘇葉多糖提取液中的色素顆粒幾乎被去除而使脫色率增長(zhǎng)緩慢；而當(dāng)脫色率趨于穩(wěn)定時(shí)，多余的活性炭轉(zhuǎn)而吸附多糖導(dǎo)致多糖損失明顯地增大，綜合脫色率和多糖損失率兩個(gè)指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果，活性炭用量宜選擇0.75%左右為宜。

圖2 不同活性炭用量的脫色效果Figure 2 Effect of activated carbon dosage on decolorization

2.3 脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響

由圖3可知，伴隨著脫色時(shí)間的增加，紫蘇葉多糖提取液脫色率呈先增加后略有下降的趨勢(shì)，而多糖損失率呈先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)活性炭用量一定時(shí)，色素顆粒與多糖分子間存在競(jìng)爭(zhēng)性吸附關(guān)系，因此，脫色時(shí)間僅為5min時(shí)，脫色率較低而多糖損失率較高；活性炭吸附屬物理過(guò)程，是一種動(dòng)態(tài)的吸附與解析的過(guò)程［22］，因此，隨著脫色時(shí)間延長(zhǎng)，多糖分子解析而色素顆粒進(jìn)一步吸附導(dǎo)致脫色率繼續(xù)上升而多糖損失率下降的現(xiàn)象；繼續(xù)延長(zhǎng)脫色時(shí)間，色素顆?？赡艽嬖诮馕鲞^(guò)程和多糖分子再吸附緣故而出現(xiàn)脫色率略有下降而多糖損失率上升的現(xiàn)象。

2.4 脫色溫度對(duì)脫色效果的影響

圖3 不同脫色時(shí)間的脫色效果Figure 3 Effect of decoloring time on decolorization

圖4 脫色溫度對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的影響Figure 4 Effect of decoloring temperature on decolorization

由圖4可知，隨著脫色溫度的升高，紫蘇葉多糖提取液脫色率逐漸增加，但持續(xù)的高溫并未使脫色率顯著上長(zhǎng)反而導(dǎo)致多糖損失明顯增加。這是由于溫度升高有利于分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)及多糖分子的解析從而加強(qiáng)了色素顆粒與活性炭之間的吸附［21］。在較低溫度條件下，由于多糖分子解析速度加快而使紫蘇葉多糖損失率逐漸下降，但升高溫度可能是由于較高溫度破壞了多糖結(jié)構(gòu)導(dǎo)致?lián)p失率的增加。綜合脫色效果，本試驗(yàn)宜采用60℃左右的脫色溫度。

2.5 pH值對(duì)脫色效果的影響

由圖5可知，隨著pH的上升，紫蘇葉多糖提取液脫色率總體呈下降趨勢(shì)，多糖損失率呈先下降后上升的趨勢(shì)。這是因?yàn)橐话闱闆r下，活性炭在酸性條件下比在堿性條件下的吸附能力強(qiáng)，而多糖在堿性條件下比在酸性條件下穩(wěn)定。因此，選擇pH 5.5時(shí)脫色效果較好。

圖5 不同pH值的脫色效果Figure 5 Effect of pH on decolorization

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.6.1 響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面法的因素水平編碼表，見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

根據(jù)Box－Benhnken設(shè)計(jì)方案進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，所得結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.6.2 模型回歸擬合 經(jīng)多元回歸擬合后，得到紫蘇葉多糖脫色率（Y1）和紫蘇葉多糖損失率（Y2）對(duì)活性碳用量、脫色時(shí)間、脫色溫度、pH的二次多項(xiàng)回歸方程分別為：

2.6.3 模型有效性檢驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)模型的有效性，采用Design－Expert 7.1.3軟件對(duì)模型進(jìn)行方差分析，所得結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 回歸模型方差分析及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

表3 回歸模型方差分析及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

“＊＊”表示極顯著；“＊”表示顯著。

變異來(lái)源 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 502.327 7 14 35.880 5 2.738 9 0.044 0＊X1 0.000 8 1 0.000 8 0.000 1 0.993 8 X2 72.030 0 1 72.030 0 5.498 3 0.037 1 ＊X3 11.603 3 1 11.603 3 0.885 7 0.365 2 X4 10.640 8 1 10.640 8 0.812 3 0.385 2 X1X2 74.822 5 1 74.822 5 5.711 5 0.034 1 ＊X1X3 6.002 5 1 6.002 5 0.458 2 0.511 3 X1X4 9.302 5 1 9.302 5 0.710 1 0.415 9 X2X3 0.250 0 1 0.250 0 0.019 1 0.892 4 X2X4 4.622 5 1 4.622 5 0.352 9 0.563 5 X3X4 165.122 5 1 165.122 5 12.604 4 0.004 0 ＊＊X12 33.779 3 1 33.779 3 2.578 5 0.134 3 X22 51.115 6 1 51.115 6 3.901 9 0.041 7 ＊X32 3.815 6 1 3.815 6 0.291 3 0.599 3 X42 19.934 8 1 19.934 8 1.521 7 0.241 0失擬差 155.497 5 10 15.549 8 18.222 4 0.053 1純誤差 1.706 7 2 0.853 3總和659.531 8 26

由表3可知，方程的模型顯著性P＜0.05，顯著，則模型有意義；失擬差P為0.053 1＞0.05，不顯著，即回歸模型與實(shí)際的試驗(yàn)數(shù)值無(wú)明顯的差異。該模型的校正決定系數(shù)為＝0.967 2，說(shuō)明該模型至少能解釋96.72%響應(yīng)值的變化，僅僅只有總變異大約3.28%無(wú)法解釋?zhuān)欢嚓P(guān)系數(shù)為R2＝0.961 6，表明該模型具有良好的擬合程度，試驗(yàn)誤差小，該模型可用于預(yù)測(cè)脫色過(guò)程色素脫除情況。模型一次項(xiàng)X2（P＜0.05）的系數(shù)顯著，交互項(xiàng) X1X2（P＜0.05）的系數(shù)顯著、X3X4（P＜0.01）的系數(shù)高度顯著，二次項(xiàng) X22（P＜0.05）的系數(shù)顯著，其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著。平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有影響，說(shuō)明響應(yīng)值與試驗(yàn)因素之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系［23］。

由表4可知，方程的模型顯著性P＜0.000 1，極顯著，則模型有意義；失擬差P為0.593 5＞0.05，不顯著，即回歸模型與實(shí)際的實(shí)驗(yàn)值無(wú)明顯差異。模型校正決定系數(shù)＝0.921 3，說(shuō)明該模型至少能解釋92.13%響應(yīng)值的變化，但仍然有總變異大約7.87%無(wú)法解釋?zhuān)幌嚓P(guān)系數(shù)R2＝0.929 5，表明該模型具有良好的擬合程度，試驗(yàn)誤差小，該模型可用于預(yù)測(cè)脫色過(guò)程中多糖損失情況。模型一次項(xiàng)X1、X2、X4（P＜0.01）的系數(shù)高度顯著；二次項(xiàng) X22（P＜0.01）的系數(shù)高度顯著；交互項(xiàng)X2X4（P＜0.000 1）的系數(shù)極顯著，其他項(xiàng)系數(shù)均不顯著。平方項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值有影響，說(shuō)明響應(yīng)值與試驗(yàn)因素之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.6.4 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)曲面圖和等高線圖能直觀分析各考察因素之間的交互作用及與響應(yīng)值之間的關(guān)系，見(jiàn)圖6～11。

表4 回歸模型的方差分析及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

表4 回歸模型的方差分析及系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Variance analysis of the regression equation and significance test for the regression coefficients

“＊＊”表示極顯著；“＊”表示顯著。

變異來(lái)源 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 4 994.615 4 14 356.758 2 10.034 1 ＜0.000 1＊＊＊X1 660.083 3 1 660.083 3 18.565 4 0.000 9 ＊＊X2 672.003 3 1 672.003 3 18.900 6 0.000 9 ＊＊＊X3 92.407 5 1 92.407 5 2.599 0 0.132 9 X4 948.740 8 1 948.740 8 26.684 1 0.000 2 ＊＊X1X2 39.062 5 1 39.062 5 1.098 7 0.315 2 X1X3 7.840 0 1 7.840 0 0.220 5 0.647 1 X1X4 31.922 5 1 31.922 5 0.897 8 0.362 1 X2X3 30.250 0 1 30.250 0 0.850 8 0.374 5 X2X4 1 207.562 5 1 1 207.562 5 33.963 7 ＜0.000 1 ＊＊＊X3X4 42.902 5 1 42.902 5 1.206 7 0.293 5 X12 1.001 5 1 1.001 5 0.028 2 0.869 5 X22 731.120 4 1 731.120 4 20.563 4 0.000 7 ＊＊X32 0.171 2 1 0.171 2 0.004 8 0.945 8 X42 148.637 9 1 148.637 9 4.180 6 0.063 5失擬差 356.367 5 10 35.636 8 1.0140 4 0.593 5純誤差 70.286 7 2 35.143 3總合5 421.269 6 26

由圖6（a）可知，活性炭用量和脫色時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖提取液的脫色率的影響明顯，曲線變化均較為陡峭，但從等高線圖可知二者的交互作用不顯著。由圖6（b）可知，活性炭用量和脫色時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，曲線變化較為陡峭，二者的交互作用顯著，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。

由圖7（a）可知，活性炭用量對(duì)紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，脫色溫度的影響不明顯，且二者的交互作用不顯著。由圖7（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故活性炭用量和脫色溫度對(duì)紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

圖6 活性炭用量和脫色時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應(yīng)Figure 6 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and decoloring time on decolorization of perilla leaf polysaccharide

由圖8（a）可知，活性炭用量和pH對(duì)紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。由圖8（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故活性炭用量和pH對(duì)紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

圖7 活性炭用量和脫色溫度對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應(yīng)Figure 7 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and decoloring temperature on decolorization of perilla leaf polysaccharide

圖8 活性炭用量和pH對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應(yīng)Figure 8 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of activated carbon dosage and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

圖9 脫色時(shí)間和脫色溫度對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應(yīng)Figure 9 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring time and decoloring temperature on decolorization of perilla leaf polysaccharide

由圖9（a）可知，脫色時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，脫色溫度的影響不明顯；等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明二者的交互作用顯著。由圖9（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故脫色時(shí)間和脫色溫度對(duì)紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

由圖10（a）可知，脫色時(shí)間和pH對(duì)紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯；等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明二者的交互作用顯著。由圖10（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故脫色時(shí)間和pH對(duì)紫蘇葉多糖損失率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。

由圖11（a）可知，脫色溫度和pH對(duì)紫蘇葉多糖提取液脫色率的影響明顯，但二者的交互作用不顯著。由圖11（b）可知，曲線變化均較為陡峭，故脫色溫度和pH對(duì)紫蘇葉多糖損失率有影響，但二者的交互作用不顯著。

圖10 脫色時(shí)間和pH對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應(yīng)Figure 10 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring time and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

圖11 脫色溫度和pH對(duì)紫蘇葉多糖脫色效果的交互效應(yīng)Figure 11 There－dimensional response surface graphs showing combined effects of decoloring temperature and pH on decolorization of perilla leaf polysaccharide

2.6.5 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 采用 Design－Expert7.1.3軟件分析回歸模型，得出紫蘇葉多糖的最優(yōu)脫色工藝參數(shù)：活性炭用量0.58%，脫色時(shí)間15min，脫色溫度50℃，pH 6.0，紫蘇葉多糖脫色率的預(yù)測(cè)值為99.99%，紫蘇葉多糖損失的預(yù)測(cè)值為5.05%。采用上述優(yōu)化的脫色工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得紫蘇葉多糖脫色率為99.63%、紫蘇葉多糖損失率為5.25%，與理論預(yù)測(cè)值差別不大。

3 結(jié)論

植物色素苷在紫蘇葉片中大量存在且與所提取的多糖具有相同的溶解性能，均為水溶性。提取時(shí)，大量的色素被提取出來(lái)混入多糖中，為了進(jìn)一步研究紫蘇葉多糖的生物活性、多糖組成及結(jié)構(gòu)等，必須對(duì)其進(jìn)行分離純化?；钚蕴糠撋哂形叫阅軓?qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，成為植物多糖脫色處理的常用方法之一。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，響應(yīng)面法優(yōu)化活性炭脫色的結(jié)果表明，紫蘇葉多糖提取液的最佳活性炭脫色工藝條件為：活性炭用量0.58%，pH 6.0，溫度50℃，時(shí)間15min，紫蘇葉多糖提取液脫色率達(dá)99.99%，多糖損失率為5.05%。與其它植物多糖脫色工藝比較，本研究具有高脫色率、低多糖損失的優(yōu)點(diǎn)。

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