田紅霞 張緒超 王震 陳劍光 陳世良 郭偉浜 楊素清 吳一龍

·臨床研究與應用·

MassARRAY質(zhì)譜分析肺癌多基因突變方法的建立與應用*

田紅霞 張緒超 王震 陳劍光 陳世良 郭偉浜 楊素清 吳一龍

目的：以MassARRAY質(zhì)譜iPLEX分析技術為平臺建立適合中國肺癌人群多基因同步檢測的方法。方法：通過文獻檢索并結合國內(nèi)外研究進展，確定與中國肺癌人群發(fā)病、耐藥以及轉移等密切相關的13個靶基因或相關傳導通路基因（EGFR、KRAS、ALK、FGFR1、FGFR2、FGFR3、PIK3CA、BRAF、PTEN、MET、ERBB2、AKT1、STK11）。對目的基因突變進行篩選并確定99個熱點突變。按MassARRAY突變位點標示方法和引物設計固定格式，引物設計軟件在線設計297條引物（正、反向擴增引物和延伸引物各99條）。以8個肺癌細胞系以及6例腫瘤組織樣本建立檢測方法，與LungCarta試劑盒對比驗證。擴大檢測100例肺癌組織樣本，與EGFR和KRAS直接測序法比較敏感度與特異度。結果：使用本方法檢測肺癌細胞系的基因突變，其中1例肺癌組織新檢測到FGFR2基因突變，其他結果與LungCarta試劑盒一致。與直接測序法相比較靈敏度為100%，特異度為96.3%。結論：成功建立MassARRAY質(zhì)譜分析肺癌多基因突變檢測方法，適合中國肺癌人群且具有臨床應用前景。

肺癌 驅(qū)動基因 突變 多基因檢測 MassARRAY

肺癌是我國惡性腫瘤死亡原因之首，發(fā)病率持續(xù)上升，基于基因變異的“精準治療”是繼傳統(tǒng)放化療后腫瘤領域的新突破。非小細胞肺癌（no-small cell lung cancer，NSCLC）樣本中基因靶點變異可從相應的靶向藥物治療中獲益，針對EGFR和ALK基因突變的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）吉非替尼/厄洛替尼和克唑替尼等靶向治療可延長患者的生存期［1-2］。隨著研究深入，不斷有新的突變被報道，而且大部分患者接受TKI治療后會因繼發(fā)突變而導致耐藥，腫瘤靶點分子分型的復雜性決定了開展同步多基因檢測的必要性。

基于MassARRAY平臺的iPLEX技術利用單堿基延伸技術和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜技術，可以實現(xiàn)多重擴增反應基因型檢測。主要特點為進行單管多重PCR，在PCR擴增產(chǎn)物中加入序列特異延伸引物，延伸引物設計位于突變位點前一個堿基，在突變位點處可延伸一個堿基。飛行時間質(zhì)譜檢測經(jīng)激光解離的離子，可區(qū)分延伸堿基的分子量，從而判斷目的基因是否突變。該技術分型結果準確，實驗設計靈活，是多基因平行檢測的理想平臺。目前LungCarta試劑盒［3-4］可檢測26個癌癥相關基因的214個突變位點，但技術信息保密，價格昂貴，且未完全包括前沿分子靶點，也未考慮東亞和歐美地區(qū)驅(qū)動基因譜的差異性［5］，因此建立適合中國人群的多基因檢測方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2014年1月至2014年12月106份肺癌患者腫瘤組織樣本來源于廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所，樣本收集已獲得患者知情同意，并獲廣東省人民醫(yī)院倫理委員會審查批準（粵醫(yī)科倫理2013185H號）。均為手術切除腫瘤組織或肺穿刺標本，手術切除后液氮速凍，然后-80℃冰箱保存，經(jīng)病理評估含有50%以上的腫瘤細胞；8個肺癌細胞系H460、PC9、H1650、H1975、A549、GLC82、L78、HCC827購買于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑與儀器 QIAsymphony DNA Mini Kit（德國Qiagen公司）；LungCarta kit、PCR輔助set、iPLEX Pro Reagent Kit（美國Agena公司）；去離子水（美國Sigma公司）。QIAsymphony SP高通量全自動核酸提取純化儀（德國Qiagen公司）；質(zhì)譜分析儀和點樣儀（美國Agena公司）；3730測序儀和PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 多基因檢測引物試劑盒的制備 1）確定肺癌相關驅(qū)動基因或靶向耐藥基因。通過檢索Pubmed數(shù)據(jù)庫，結合國內(nèi)外研究進展和中國人群肺癌基因譜特點，統(tǒng)計與中國人群肺癌發(fā)病機理、化放療、靶向耐藥以及轉移等相關的靶基因或其相關傳導通路基因，確定13個基因納入分析：EGFR、KRAS、ALK、FG?FR1、FGFR2、FGFR3、PIK3CA、BRAF、PTEN、MET、ERBB2、AKT1和STK11。2）篩選目的基因的熱點突變位點。在Cosmic數(shù)據(jù)庫中確定上述13個基因的Cosmic基因號分別為EGFR（ENST00000275493）、KRAS（ENST00000256078）、ALK（ENST00000389048）、FGFR1（ENST00000447712）、FGFR2（ENST0000035 8487）、FGFR3（ENST00000440486）、PIK3CA（ENST0 0000263967）、BRAF（ENST00000288602）、PTEN（ENST 00000371953）、MET（ENST00000318493）、ERBB2（ENS T00000269571）、AKT1（ENST00000349310）、STK11（E NST00000326873）。查詢上述基因在肺癌中的變異情況，確定99個與肺癌驅(qū)動及耐藥相關的熱點突變位點（表1）。3）引物設計文檔編輯和軟件設計。GenBank確定基因組序列，基因序列號分別為EGFR（NG_ 007726.3）、KRAS（NG_007524.2）、ALK（NG_009445.1）、FGFR1（NG_007729）、FGFR2（NG_012449.1）、FGFR3（NG_012632.1）、PIK3C（NG_012113.2）、BRAF（NG_ 007873.3）、PTEN（NG_007466.2）、MET（NG_008996.1）、ERBB2（NG_007503.1）、AKT1（NG_012188.1）、STK11（NG_007460.2）。根據(jù)Cosmic數(shù)據(jù)庫中突變位點在編碼序列的位置，在基因組序列中標記突變位點，將側翼約200個堿基按Agena公司突變位點標示和固定格式編輯引物設計文檔。通過公司網(wǎng)站引物設計軟件運行上述含突變位點序列的文檔，調(diào)整相關參數(shù)將13個基因99個位點全部納入設計試劑盒，正、反向擴增引物各99條和延伸引物99條，共設計297條引物。擴增目的條帶，延伸引物設計位于突變位點前一個堿基，與擴增產(chǎn)物互補進行單堿基延伸反應。設定每孔最多檢測十個突變位點，軟件根據(jù)引物設計原則（避免形成二聚體/錯配等）隨機將99個位點的檢測分布在12孔（專利申請?zhí)枺?01510311868.8）。4）多重引物的合成與配置。上海生工生物工程有限公司合成引物。引物配置如下：①擴增引物先稀釋成10 μM，然后工作液以每條引物濃度為0.5 μM進行混合，共12管（每管包括正、反向引物）。引物名稱末尾為P1-F和P1-R分為第1組，引物名稱末尾為P2-F和P2-R分為第2組，類推，分為12組（P1～P12）；②延伸引物先稀釋成500 μM，然后在Agena公司延伸引物配置表格中輸入每一條延伸引物的分子量，再根據(jù)表格計算的體積混合引物，共12管。引物名稱末尾為E1為第1組，引物名稱末尾為E2為第2組，類推，分為12組（E1～E12）。12管擴增引物分別對應12管延伸引物，P1對應E1，以此類推。

1.2.2 建立引物試劑盒應用方法 1）選用已知突變位點的H460、PC9、H1650、H1975、A549、GLC82、HCC827、H1299的8個肺癌細胞系和6例肺癌患者組織樣本建立檢測方法。以正常人基因組DNA（正常人包皮組織，已獲知情同意）做為陰性對照，水為空白對照。每個樣本檢測需要DNA 120 ng，即10 ng/孔× 12孔。2）操作方法按照MassARRAY系統(tǒng)平臺進行。其中LungCarta試劑盒按其說明書操作。本研發(fā)引物試劑盒的操作具體如下：①使用PCR Accessory Set進行核酸擴增。按QIAsymphony DNA Mini Kit試劑盒操作指南在QIAsymphony SP高通量全自動核酸提取純化儀提取NSCLC標本的DNA，并進行核酸濃度定量。PCR擴增體系為：PCR緩沖液（10×）0.5 μL、MgCl2（25 mM）0.4 μL、dNTPs（25 mM）0.1 μL、PCR熱啟動酶（5 U/μL）0.2 μL、擴增引物（P1～P12）混合液1 μL、基因組DNA（10 ng/μL）1 μL，水補足至5 μL。反應條件為：94℃2min；94℃30s、56℃30s、72℃1min，45個循環(huán)；72℃5 min。②蝦堿性磷酸酶（shrimp alka?line phosphatase，SAP）去除PCR產(chǎn)物中dNTP。在步驟①PCR產(chǎn)物中加入SAP（1.7 U/μL）0.3 μL、SAP緩沖液（10×）0.17 μL、水補足至7 μL。反應條件為：37℃40 min，85℃5 min。3）使用iPLEX Pro Reagent Kit進行延伸反應。在步驟②得到的產(chǎn)物中加入Type?plex緩沖液（10×）0.2 μL、Typeplex termination混合液（10×）0.2 μL、Typeplex thermosequenase酶（33 U/μL） 0.041 μL、延伸引物（E1～E12）混合液0.804 μL、水補足至9 μL。反應條件為：94℃30 s；［94℃5 s、（52℃5 s、80℃5 s）5個循環(huán)］35個循環(huán)；72℃3 min。4）在步驟③產(chǎn)物中加入水41 μL，清潔樹脂15 mg（96孔板），旋轉板30～60 min進行脫鹽去離子防干擾處理；3 200×g離心5 min。5）MassARRAY系統(tǒng)點樣儀對步驟④上清的延伸產(chǎn)物進行芯片點樣，利用分析儀掃描芯片；掃描結果以Typer4.0軟件分析。根據(jù)突變位點處堿基分子量不同，時間飛行質(zhì)譜掃描區(qū)分各目的基因的突變狀況，在質(zhì)譜峰突變堿基處出現(xiàn)峰，則判斷為突變。

1.2.3 敏感度與特異度比較 選取100例肺癌組織樣本，用本肺癌研究所已經(jīng)建立的直接測序法檢測EGFR、KRAS基因的本研究方法包含的突變位點，與本研究方法檢測結果比較敏感度與特異度，直接測序法按ABI 3730測序儀標準操作流程進行［6］。

2 結果

2.1 多基因引物試劑盒包含的突變位點

與肺癌驅(qū)動發(fā)生以及靶向治療耐藥等相關的13個基因的99個堿基突變位點納入到多基因檢測試劑盒進行引物設計，具體分析基因的蛋白突變位點見表1。

2.2 在肺癌細胞系中進行驗證

建立方法檢測8例肺癌細胞系的突變位點，驗證結果顯示與已報道的突變情況（美國標準菌種收藏所細胞系）一致，具體基因的突變蛋白與堿基位點結果見表2。陰性對照以及空白對照均沒有檢測到基因突變。

表1 發(fā)明試劑盒包含的13個基因的蛋白變異位點Table 1 Protein mutation locus of 13 genes in the proposed kit

表2 在肺癌細胞系驗證檢測結果Table 2 Validation of the established method by using cell lines

2.3 在肺癌患者組織樣本中與LungCarta法比較檢測結果

建立方法檢測6例肺癌組織樣本，與LungCarta試劑盒檢測結果比較如表3。使用本法在1例肺癌患者組織樣本（K1747T）中檢測到FGFR2基因突變，而使用LungCarta試劑盒檢測未發(fā)現(xiàn)該位點突變（圖1）。在其他組織樣本中與LungCarta試劑盒檢測結果完全一致（圖2）。

2.4 與直接測序法比較靈敏度與特異度

按新建立方法檢測100例肺癌患者的腫瘤樣本，同時直接測序法檢測本研究方法包含的EGFR、KRAS基因的突變位點，本方法的靈敏度為100%，特異度為96.3%，陽性預測值為95.8%，陰性預測值為100%。具體的對比結果見表4。

表3 在肺癌組織樣本中比較新建立方法與LungCarta試劑盒的檢測結果Table 3 Validation of the proposed method by comparing with a Lung?Carta kit with lung cancer tissue samples

圖1 新建立方法在K1747T肺癌組織樣本中檢測到FGFR2基因突變Figure 1 FGFR2 gene mutation was detected in the K1747T lung cancer tissue sample by using the proposed method

圖2 新建立方法和LungCarta均在K1736T肺癌組織樣本檢測到共存EGFR_L858R、MET_N375S突變Figure 2 Coexistence of EGFR_L858R and MET_N375S in the K1736T lung cancer tissue sample was detected by using the proposed method and the LungCarta kit

表4 新建立方法的靈敏度與特異度分析Table 4 Sensitivity and specificity analyses of the proposed method

3 討論

在肺癌的分子分型方面，目前臨床單基因檢測方法主要有定量聚合酶鏈反應（quantitative poly?merase chain reaction，qPCR）、直接測序、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）、免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）等。除了EGFR、ALK、KRAS等主要基因的檢測技術在臨床相對成熟之外，ROS1、RET、MET、HER2、NRTK、NRG等基因臨床檢測主要限制因素有：多個單基因分次檢測的復雜性和臨床來源標本總量不夠。臨床上肺癌早期患者接受手術（大手術或小手術活檢）具有充足的組織，晚期患者通常通過經(jīng)皮肺穿刺、支氣管鏡活檢、支氣管內(nèi)超聲穿刺活檢等獲得少量標本。這些標本滿足現(xiàn)有的臨床病理診斷和個別基因的分子檢測后，很難有剩余材料進一步用于其他重要分子分型、藥物耐藥機制等分析?？梢娔[瘤樣本少、低通量、耗時性及價格昂貴等是制約臨床多次單個基因檢測開展的瓶頸。腫瘤發(fā)生發(fā)展、靶向耐藥、復發(fā)轉移的復雜性，以及肺癌多靶點突變分別檢測的局限性，決定了在臨床轉化醫(yī)學研究中開展多基因檢測的發(fā)展趨勢。

基于二代測序平臺的高通量測序是目前生命科學領域最重要的“精準治療”依托技術之一，NSCLC個體化分型的CAPP-CA（CAner personalized profiling by deep sequencing）、Snapshot等多基因檢測技術亦已研發(fā)建立［7-8］。MassARRAY技術通過擴增延伸反應與質(zhì)譜相結合實現(xiàn)基因的分型檢測。本平臺操作程序簡單，可基于96/384孔板開展多基因檢測，改變傳統(tǒng)單基因檢測價格昂貴，耗時長，操作繁瑣等劣勢。本平臺PCR反應產(chǎn)物片段短，不僅可檢測新鮮組織樣本，還可檢測石蠟組織、胸水、穿刺等樣本［3-4］。LungCarta試劑盒檢測肺癌基因突變雖然已經(jīng)商品化應用［9］，但技術信息保密，價格昂貴，且未完全包括前沿分子靶點，并且東亞和歐美地區(qū)驅(qū)動基因譜具有差異性。本方法根據(jù)國內(nèi)外研究進展，納入ALK、MET、FGFR等13個中國人群肺癌相關基因的99個熱點突變，如原發(fā)MET基因突變與EGFR TKI的靶向治療耐藥相關［10-11］、ALK基因的多個位點突變與Crizontinb靶向治療耐藥相關［12］。目前研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤中存在FGFR信號通路的異常激活［13-14］，本研究在1例肺癌患者組織樣本中檢測到FGFR2基因存在突變，表明多基因平行檢測方法具有前沿優(yōu)勢，可為臨床患者提供更準確的基因變異信息。同時由于質(zhì)譜分析準確性與敏感性高，較直接測序法具有無可比擬的優(yōu)勢［15］。本研究中基于質(zhì)譜平臺建立的多基因檢測方法與直接測序法比較，特異度為96.3%，可能與質(zhì)譜的高敏感性相關，可彌補直接測序法低敏感度導致的假陰性。

建立的肺癌多基因檢測方法具有如下獨特優(yōu)勢：1）考慮了歐美人群與亞洲人群肺癌基因譜的差異性，檢測基因更前沿，并納入了多個與肺癌靶向治療相關的耐藥位點，檢測結果將為優(yōu)化“精準治療”分子分型，篩查技術方案以及靶向治療后耐藥研究提供依據(jù)。2）本引物試劑盒自主研發(fā)，在價格上存在優(yōu)勢，降低了患者的臨床檢測費用，可轉化研究應用于臨床，產(chǎn)生經(jīng)濟效益和優(yōu)化臨床資源配置。3）本檢測方法以96或384孔板多重反應分析為基礎，具有高通量性，在12孔同步檢測13個基因的99個位點，可實現(xiàn)“單個小樣本多基因的檢測”，使小樣本最大化使用、獲得最大信息量。本檢測方法的成功建立可使肺癌生物標志物檢測的醫(yī)療成本合理化，具有廣闊的臨床應用前景。

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（2015-07-27收稿）

（2015-08-19修回）

（編輯：楊紅欣）

田紅霞 專業(yè)方向為腫瘤生物標志物檢測。

E-mail：gghtianer@163.com

肝癌規(guī)范化診療國際高峰論壇會議通知

由《中國腫瘤臨床》編輯部、天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院共同主辦的“肝癌規(guī)范化診療國際高峰論壇”將于2015年12月19日在天津舉行。會議將邀請著名肝膽外科專家復旦大學附屬中山醫(yī)院樊嘉教授、清華大學長庚醫(yī)院董家鴻教授、天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院李強教授，以及臺灣高雄長庚醫(yī)院陳肇隆教授、日本東京大學國土典宏教授、韓國盆唐醫(yī)院韓虎生教授、香港大學潘冬平教授、國立臺灣大學黃凱文教授等肝膽外科領域的頂級專家學者就肝癌規(guī)范化診療、高難度外科手術以及微創(chuàng)外科做專題報告。此次會議期間將開設手術視頻，展示操作技術。

本次會議將報道肝癌規(guī)范化診療的最新進展，展示肝膽外科領域的高超手術技術，力爭為國內(nèi)外同行搭建學術交流的平臺，提高我國肝癌規(guī)范化診療水平，歡迎各位同道撥冗參加。

會務組聯(lián)系人及聯(lián)系方式：

張 偉：18622025401 zhangweitjch@163.com

宋天強：022-23340123-3093 周曉穎：022-23527053-800

——本刊編輯部

Establishment and application of a MassARRAY platform-based method to detect multiplex genetic mutations in lung cancer

Hongxia TIAN,Xuchao ZHANG,Zhen WANG,Jianguang CHEN,Shiliang CHEN,Weibang GUO,Suqing YANG,Yilong WU

Medical Research Center,Guangdong Lung Cancer Institute,Guangdong People's Hospital,Guangdong Academy of Medical Science,Guangzhou 510080,China.
This work was supported by the Special Funds for the Scientific Research of Public Welfare from the National Health and Family Planning Commission of China(Grant No.201402031),the Key Lab Construction Project from Guangdong Provincial Department of Science and Technology(Grant No.2012A061400006),and the Special Program for Clinical Research from Guangdong Provincial People's Hospital(Grant No.2014zh006).

Objective:To establish a method based on the iPLEX analysis of MassARRAY mass spectrometry platform to detect multiplex genetic mutations among Chinese lung cancer patients.Methods:We reviewed the related literature and data of lung cancer treatments.We also determined 99 mutation hot spots in 13 target genes,namely,EGFR,KRAS,ALK,FGFR1,FGFR2,FGFR3,PIK3CA, BRAF,PTEN,MET,ERBB2,AKT1,and STK11,which are closely related to the pathogenesis,drug resistance,and metastasis of lung cancer and are associated with relevant transduction pathways.Atotal of 297 primers comprising 99 paired forward and reverse amplification primers and 99 matched extension primers were designed by usingAssay Design in accordance with the mutation label and format requirements of the MassARRAY platform.The detection method was established by analyzing eight cell lines and six lung cancer specimens;the proposed method was then validated through comparisons with a LungCarta kit.The sensitivity and specificity of the proposed method were evaluated by directly sequencing EGFR and KRAS genes in 100 lung cancer cases.Results:The proposed method could detect multiplex genetic mutations in the lung cancer cell lines,and this finding is consistent with that observed using previously reported methods.The proposed method could also detect such mutations in clinical lung cancer specimens;this result is also consistent with that observed by using the LungCarta kit.However,an FGFR2 mutation was detected only by using the proposed method.The measured sensitivity and specificity were 100%and 96.3%,respectively.Conclusion:The proposed MassARRAY technology-based method could detect multiplex genetic mutations among Chinese lung cancer patients.Indeed,the proposed method can be potentially applied to detect mutations in cancer cells.

lung cancer,driver gene,mutation,multi-gene testing,MassARRAY

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.17.797

廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學科學院）肺癌研究所醫(yī)學研究中心（廣州市510080）

*本文課題受國家衛(wèi)計委公益性行業(yè)科研專項項目（編號：201402031）、廣東省科技廳重點實驗室建設項目（編號：2012A061400006）和廣東省人民醫(yī)院臨床研究專項項目（編號：2014zh006）資助

吳一龍 syylwu@live.cn