王新惠 白 婷 李俊霞，2 羅 靜

（1.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都 610106；2.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 611743）

發(fā)酵肉制品由于富含蛋白質(zhì)和氨基酸，在成熟、貯藏過程中，游離組氨酸易在氨基酸脫羧酶的作用下生成組胺。組胺是生物胺中毒性最強，對人體健康危害最大的一種生物胺。它是一種過敏性物質(zhì)，會引起毛細(xì)血管擴張和支氣管收縮，導(dǎo)致患者頭疼、頭暈、胸悶、全身乏力和煩躁等。此外，組胺與亞硝酸鹽反應(yīng)可能形成致癌性物質(zhì)N－亞硝胺［1］。研究［2］表明，發(fā)酵香腸、臘肉等發(fā)酵肉制品含有較高濃度的組胺，隨機抽檢四川、重慶、江西、北京、江蘇、浙江以及廣東等不同地區(qū)的42個傳統(tǒng)發(fā)酵香腸樣品，組胺均有不同程度的檢出。據(jù)報道［3］，2002～2012年中國約發(fā)生140起食品組胺中毒事件。食品中組胺成為世界范圍公認(rèn)的、潛在的食品安全問題，已成為食品安全研究的熱點。目前，發(fā)酵肉制品及其它種類肉制品中組胺的限量還沒有明確的規(guī)定，中國一般要求低于100mg/kg，F(xiàn)DA規(guī)定食品中生物胺總量不得超過1 000mg/kg，其中組胺含量≤50mg/kg，歐盟對肉制品中組胺要求≤100mg/kg［4－7］。因此，建立準(zhǔn)確的測定發(fā)酵肉制品中組胺的分析方法有著非常重要的意義。

目前，中國測定食品中的組胺，主要采用中國GB/T 5009.45—2003《水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》（文中簡稱中國國標(biāo)法），而該法主要用于檢測水產(chǎn)品中的組胺含量［8，9］。發(fā)酵肉制品蛋白質(zhì)、油脂含量較高，中國國標(biāo)法中規(guī)定的樣品前處理方法對發(fā)酵肉制品已不適宜。本研究分別采用液相色譜法、中國國標(biāo)法和中國國標(biāo)改進(jìn)法3種方法測定香腸、臘肉等傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中的組胺，比較這3種方法的精密度和準(zhǔn)確度，旨在探討3種方法的優(yōu)劣，尋找一種較準(zhǔn)確且適合測定發(fā)酵肉制品中組胺的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑

正戊醇、三氯乙酸溶液、碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、氨基苯胺、亞硝酸鈉、酚酞、乙酸銨、高氯酸、碳酸氫鈉：分析純，北京化學(xué)試劑公司；

組胺標(biāo)物：純度≥97%，國藥集團化學(xué)有限公司；甲醇：色譜純，天津康科德科技有限公司；

丹酰氯：純度≥99.0%，上海滬鼎生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

可見紫外分光光度計：UV741型，惠普上海分析儀器有限公司；

電子天平：JA2003型，上海天平儀器廠；

高速冷凍離心機：CR22G型，日立工機株式會社；

超聲波細(xì)胞破碎儀：JY92-11N型，寧波新芝生物技術(shù)股份有限公司；

高效液相色譜：Agilent1100型，安捷倫科技有限公司；

均質(zhì)器：ZQ-Ⅱ型，天津市東康科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 準(zhǔn)確稱取（100±5）℃干燥2h的組胺磷酸鹽0.276 7g溶于蒸餾水中，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，定容，此溶液組胺濃度為1.0mg/mL。組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液配制：準(zhǔn)確吸取1.0mL組胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于50mL容量瓶中定容，此溶液組胺濃度20.0μg/mL。

1.2.2 中國國標(biāo)法測定組胺 按GB/T 5009.45—2003《水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》執(zhí)行。

1.2.3 中國國標(biāo)改進(jìn)法測定組胺 根據(jù) GB/T 5009.45—2003修改如下：稱取5.00g樣品，置于具塞錐形瓶中，加入三氯乙酸溶液20mL，超聲處理（功率300W，溫度45℃）2 min后，于4℃以6 000r/min離心5min。上清液稀釋100倍后取2.0mL于10mL離心管中，加入1滴酚酞指示劑（10g/L），逐滴滴加氫氧化鈉溶液（250mg/mL）呈堿性（溶液剛呈紅色），每次加入正戊醇3mL，旋渦振蕩2min后，于4℃以2 000r/min離心5min，提取3次，合并正戊醇提取液并稀釋至10.0mL，備用。取1.0mL鹽酸提取液于10 mL比色管中，加3mL碳酸鈉溶液，3mL偶氮試劑，加水至刻度，旋渦振蕩2min，靜置10min后，480nm處測定吸光值并計算結(jié)果。

1.2.4 液相色譜法測定組胺 根據(jù)文獻(xiàn)［10］和［11］修改如下：稱取5.00g樣品，置于具塞50mL離心管中，加入0.4mol/L高氯酸溶液10mL，均質(zhì)1min后，于4 ℃以6 000r/min離心5min。上清液稀釋100倍取2.0mL置于10 mL離心管中，依次加入2mol/L氫氧化鈉100μL，飽和碳酸氫鈉300μL和10mg/mL丹酰氯溶液（溶于丙酮）1mL，蓋塞。40℃避光反應(yīng)45min后，加入濃氨水100μL終止反應(yīng)。加入乙腈使終體積為5mL，0.20μm濾膜過濾，供高效液相色譜測定。色譜測定條件［2］：檢測波長254nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量50μL，流動相A為水，流動相B為乙腈，用30%A和70%B的混合液平衡、洗脫，流速0.3mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 中國國標(biāo)法和中國國標(biāo)改進(jìn)法的標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確吸取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液分別置于6支10mL比色管中，加水至1mL。再各加1mL鹽酸（1＋11），3mL碳酸鈉溶液，3mL偶氮試劑，加水至刻度，混勻，放置10min，用1cm比色杯以零管調(diào)節(jié)零點，480nm測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.1.2 高效液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確吸取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液，依次加入2mol/L氫氧化鈉溶液100μL，飽和碳酸氫鈉溶液300μL和10mg/mL丹酰氯溶液1mL，蓋塞。40℃避光反應(yīng)45min后，定容至5 mL，振蕩均勻，0.20μm濾膜過濾，液相色譜測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

由圖1、2可知，組胺濃度在0～20μg/mL范圍內(nèi)中國國標(biāo)法、中國國標(biāo)改進(jìn)法和液相色譜法都呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，曲線相關(guān)系數(shù)都在0.99以上，其中液相色譜法更為靈敏。

圖1 分光光度法組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Histamine standard curve of spectrophotometric method

圖2 液相色譜法組胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Histamine standard curve of liquid chromatography method

2.2 中國國標(biāo)法、中國國標(biāo)改進(jìn)法和液相色譜法的精密度和準(zhǔn)確度

以某品牌的鮮肉、川味發(fā)酵香腸、廣味發(fā)酵香腸和發(fā)酵臘肉為試驗材料，加入一定量的組胺標(biāo)準(zhǔn)品使加標(biāo)值達(dá)到20 mg/kg，分別采用中國國標(biāo)法、中國國標(biāo)改進(jìn)法和液相色譜法測定樣品中的組胺含量，比較3種方法的精密度和準(zhǔn)確度。每個試樣做6次平行檢測，數(shù)據(jù)采用 Matlab ver.2006 b（Mathworks Inc.，Natick，MAUS）和 Microsoft Excel（Microsoft，Redmond，Washington，US）分析，結(jié)果見表1、2。

表1 中國國標(biāo)法、中國國標(biāo)改進(jìn)法和液相色譜法的精密度Table 1 Results of precision test of liquid chromatography method，the national standard method and the improved national standard method（n＝6）

表2 中國國標(biāo)法、中國國標(biāo)改進(jìn)法和液相色譜法的準(zhǔn)確度Table 2 Results of accuracy test of liquid chromatography method，the national standard method and the improved national standard method（n＝6）

由表1、2可知，高效液相色譜法的精密度最高，穩(wěn)定性好，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1%，而中國國標(biāo)法的精密度最差，重復(fù)性較差，波動較大，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差接近5%。液相色譜法和中國國標(biāo)改進(jìn)法測定肉制品中組胺的回收率均高于90%以上，優(yōu)于中國國標(biāo)法，準(zhǔn)確度滿足試驗要求。盧士玲［12］、張海萍［13］等報道采用液相色譜法測定發(fā)酵肉制品中組胺，靈敏度高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，優(yōu)于中國國標(biāo)法。液相色譜設(shè)備和耗材昂貴，且其前處理步驟比較繁瑣，需要經(jīng)過提取后才可衍生進(jìn)樣，因此，液相色譜法具有一定局限性。中國國標(biāo)法中所需儀器設(shè)備一般實驗室都具備，且測定費用比較低廉，因此，目前中國國標(biāo)法仍是中國檢測人員測定肉制品中組胺的主要方法之一。筆者在實際測定過程中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵肉制品蛋白質(zhì)、油脂含量較高，中國國標(biāo)法中采用提取劑常溫浸泡處理樣品，樣品中的組胺未充分進(jìn)入到提取劑中，提取率較低，導(dǎo)致測得數(shù)據(jù)比真實值偏?。恢袊鴩鴺?biāo)法中采用分液漏斗分離提取液，樣品中的蛋白質(zhì)和油脂與提取液不易分層，分離提取液易混入肉泥、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)影響樣品吸光值準(zhǔn)確度［14］。筆者在中國國標(biāo)法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)：采用超聲波輔助萃取取代了中國國標(biāo)法中室溫浸泡2～3h，改進(jìn)后回收率提高5%，耗時2min，大大縮短提取時間；正戊醇提取過程中，用離心方式取代了中國國標(biāo)法中用分液漏斗振蕩分離的方式，液相與固相實現(xiàn)良好分層，分離提取液無肉泥、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)混入，增強了測定的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，中國國標(biāo)改進(jìn)法，呈現(xiàn)出較好的精密度和準(zhǔn)確度，能滿足測定發(fā)酵肉制品中組胺試驗要求，是一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟測定發(fā)酵肉制品中組胺的方法。由此可見，試驗人員可根據(jù)實際條件和需要選擇液相色譜法或中國國標(biāo)改進(jìn)法對發(fā)酵肉制品中的組胺進(jìn)行測定。

3 結(jié)論

分別采用液相色譜法、中國國標(biāo)法和中國國標(biāo)改進(jìn)法等3種方法測定發(fā)酵肉制品中組胺，液相色譜法的精密度最高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜1%，中國國標(biāo)法的精密度最差，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差接近5%。筆者采用超聲波輔助萃取取代了中國國標(biāo)法中室溫浸泡2～3h，用離心方式取代了中國國標(biāo)法中用分液漏斗振蕩提取的方式，改進(jìn)后回收率提高5%，提取液中無肉泥、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)增強測定的穩(wěn)定性，呈現(xiàn)出較好的精密度和準(zhǔn)確度。液相色譜法和中國國標(biāo)改進(jìn)法均能滿足測定發(fā)酵肉制品中組胺的試驗要求。

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