馮　姣，鄔應(yīng)龍，夏曉杰，曾麗萍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

FENG Jiao，WU Ying-long*，XIA Xiao-jie，ZENG Li-ping

（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

齊口裂腹魚肌肉品質(zhì)及其PPARγ、PGC-1α相對(duì)表達(dá)量分析

馮姣，鄔應(yīng)龍*，夏曉杰，曾麗萍

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014）

通過對(duì)不同質(zhì)量的齊口裂腹魚肌肉品質(zhì)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)其組織中過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活子1α（PGC-1α）及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的相對(duì)表達(dá)量開展研究。結(jié)果表明：不同質(zhì)量的齊口裂腹魚肌肉中蛋白質(zhì)、粗脂肪含量存在顯著性差異（p＜0.05），其水分、灰分含量差異不顯著（p＞0.05）；肌肉的pH沒有差異，大魚的失水率高于中魚與小魚，小魚與中魚肌肉中氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸的含量均高于大魚；中、小魚的肌肉品質(zhì)高于大魚。在不同質(zhì)量齊口裂腹魚的頭腎、肝臟、肌肉中，PPARγ的相對(duì)表達(dá)量均存在顯著性差異（p＜0.05）；PGC-1α在頭腎中相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異（p＜0.05），在肝臟、肌肉中差異不顯著（p＞0.05）；PPARγ、PGC-1α在組織中的相對(duì)表達(dá)量與肌肉中粗脂肪含量有一定關(guān)聯(lián)。

齊口裂腹魚，肌肉品質(zhì)，PPARγ，PGC-1α，相對(duì)表達(dá)量

FENG Jiao，WU Ying-long*，XIA Xiao-jie，ZENG Li-ping

（College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti Tchang）屬于鯉科裂腹魚屬動(dòng)物，又名“雅魚”，廣泛分布于長(zhǎng)江上游、金沙江、青衣江、烏江下游等水域，魚肉色雪白、肉質(zhì)細(xì)嫩、肉味鮮美，是全國(guó)名菜砂鍋魚頭的首選魚頭，屬于名貴的經(jīng)濟(jì)魚類。由于齊口裂腹魚的稀有及其肉味鮮美，現(xiàn)已引起許多學(xué)者的研究興趣。溫安祥等[1]對(duì)天然齊口裂腹魚魚種、成魚及人工養(yǎng)殖的齊口裂腹魚的肌肉成分進(jìn)行了分析研究；向梟等[2]研究了飼料中五種不同來源的脂肪對(duì)齊口裂腹魚的生長(zhǎng)性能和血清中甘油三酯、總膽固醇含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等生化指標(biāo)的影響。

過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator-activated receptor，PPARs），在脂代謝過程中起著重要作用。PPARγ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ）屬PPARs的異構(gòu)體，調(diào)節(jié)包括脂質(zhì)和葡萄糖穩(wěn)態(tài)在內(nèi)的代謝過程[3]。過氧化物酶體增殖物激活受體輔激活子1α（peroxisome proliferatoractivated receptor-coactivator1α，PGC-1α）是PPARγ轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，通過調(diào)控PPARγ介導(dǎo)的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄等環(huán)節(jié)，參與調(diào)節(jié)多種脂質(zhì)代謝通路[4]。具有調(diào)節(jié)適應(yīng)性產(chǎn)熱[5-6]，促進(jìn)線粒體的合成[7]，調(diào)控骨骼肌的纖維類型轉(zhuǎn)化及葡萄糖代謝過程[8-9]，調(diào)節(jié)心肌能量代謝[10-11]等作用。林亞秋等[12]克隆了齊口裂腹魚過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARγ）輔助活化因子1α（PGC-1α），并探討了該基因在肌肉組織中的表達(dá)量。目前有關(guān)不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉的品質(zhì)及不同組織中PGC-1α、PPARγ相對(duì)表達(dá)量的研究較少。由于齊口裂腹魚生長(zhǎng)緩慢，市場(chǎng)銷售的齊口裂腹魚普遍為500g左右，本研究選取的質(zhì)量等級(jí)分別為150、300、500g，代表著稚魚、亞成魚、成魚三個(gè)不同生長(zhǎng)階段的魚體，通過本研究探明不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉品質(zhì)差異和PGC-1α、PPARγ在不同組織中相對(duì)表達(dá)量的差異，為該魚不同生長(zhǎng)階段的肌肉品質(zhì)及PGC-1α、PPARγ的研究提供參考資料。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用魚購(gòu)自四川省雅安市天全縣雅魚場(chǎng)，按照三個(gè)重量級(jí)別，簡(jiǎn)稱為大、中、小魚，每個(gè)重量級(jí)別隨機(jī)撈取20尾，經(jīng)測(cè)量得齊口裂腹魚形體指數(shù)如表1所示；RNAiso Plus、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒TaKaRa公司；瓊脂糖北京方寶生物科技有限公司；不同規(guī)格的槍頭、0.2μL PCR管GCS公司；熒光定量八聯(lián)板美國(guó)Bio-Rad公司。

表1　大、中、小魚的形體指數(shù)Table.1　The body index of large，medium and small-sized fish

HITACHI L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀日本日立公司；PCR儀器、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳槽及電泳儀美國(guó)Bio-Rad公司；微量移液槍、Centrifuge 5810R高速低溫離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肌肉品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定將魚解剖，取完各臟器樣品后，使用流水快速?zèng)_洗，去除血污等雜物，背鰭處吸干水，剝皮后，割離肉（要求無骨無刺）粉碎，密封袋儲(chǔ)存，用于魚肉常規(guī)指標(biāo)測(cè)定。采用常規(guī)烘干失重法測(cè)定魚肉中的水分含量，凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白含量，索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量，干灰化法來測(cè)定灰分；參考GB/T 5009.124-2003，測(cè)定肌肉中的氨基酸組成。

取粉碎的魚肉5g（重量即為m0），加入少量蒸餾水，用研缽碾碎勻漿，轉(zhuǎn)移到小燒杯內(nèi)，加入等量蒸餾水混和均勻，靜置10min后，提取上清液，用酸度計(jì)測(cè)定pH，做3次平行，取平均值。

取魚體背部肌肉（相同位置）5g（重量即為m0），于沸騰水中煮5min，撈出冷卻，吸去魚肉表面水分，稱重為m，做3次平行，取平均值。失水率計(jì)算公式為：

1.2.2PPARγ、PGC-1α相對(duì)定量

1.2.2.1組織取樣PGC-1α主要在能量代謝旺盛的肝臟、肌肉、腎臟中表達(dá)，具有明顯的組織特異性[13-14]。將魚禁食12h后撈出，解剖，取其頭腎、肌肉、肝臟迅速標(biāo)記通過液氮轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存。

1.2.2.2磨樣將從三尾魚取出的相同組織放入研缽中通過液氮研磨混樣，每種體型魚的每個(gè)組織做三個(gè)平行，研磨好后迅速裝入提前冷凍好的EP管中，并迅速通過液氮轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄為cDNA嚴(yán)格按照寶生物工程有限公司RNAiso Plus試劑說明書提取齊口裂腹魚各組織的總RNA，用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。為防止RNA的降解，用1μL的總RNA按照TaKaRa公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒處理得到第一股cDNA。

1.2.2.4熒光定量引物設(shè)計(jì)與合成：以齊口裂腹魚β-actin基因序列（JQ013000）為依據(jù)設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的引物；采用Primer Premier 5.0軟件，參考GenBank中草魚PPARγ基因序列（Eu847421.1）和PGC-1α基因序列（JN195739）的保守區(qū)域，設(shè)計(jì)用于齊口裂腹魚PPARγ、PGC-1α基因擴(kuò)增的正反引物，序列如表2所示。

表2　引物序列及退火溫度Table.2　Primer sequences and anneal temperature

實(shí)時(shí)熒光定量PCR基因檢測(cè)：使用1.2.2.3步驟中制備的cDNA，按照TaKaRa公司生產(chǎn)的熒光定量試劑盒說明書，配制10μL反應(yīng)體系于0.2mL八聯(lián)管中，含5μL SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）、上下游引物各0.25、1μL cDNA、3.5μL DEPC水。熒光定量PCR程序?yàn)?5℃3min；95℃10s，退火溫度（待測(cè)基因）30s，39個(gè)循環(huán)；95℃10s；擴(kuò)增完畢后，迅速降溫到65℃進(jìn)行溶解曲線分析，然后以0.5℃/s的速率從65℃遞增到95℃，連續(xù)測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線。

相對(duì)表達(dá)量分析：以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)擴(kuò)增曲線得到的Ct值（熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），利用推導(dǎo)公式相對(duì)表達(dá)量=2-△Ct[15]計(jì)算出目標(biāo)基因（PPARγ、PGC-1α）的相對(duì)表達(dá)量，從而制作相對(duì)表達(dá)量圖表，式中△Ct=Ct待測(cè)基因－Ctβ-actin。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

部分?jǐn)?shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用SPSS 20.0軟件單因素方差分析組間數(shù)據(jù)，通過Duncan’s多重比較法分析結(jié)果的差異顯著性，p＜0.05為顯著性差異，p＞0.05為無顯著性差異，部分?jǐn)?shù)據(jù)以平均值表示。

2　結(jié)果與分析

2.1不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)分析

2.1.1不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉基本成分分析水分、脂肪、蛋白質(zhì)、灰分是肌肉中的主要組成成分。不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉的基本成分見表3。由表3可知不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉中粗脂肪含量有著顯著性差異（p＜0.05），大魚中的脂肪含量最低；小魚與中魚肌肉中蛋白質(zhì)含量差異不顯著（p＞0.05），但顯著高于大魚中的蛋白質(zhì)含量；大、中、小魚肌肉中水分、灰分含量無顯著性差異（p＞0.05）。

表3　齊口裂腹魚的基本成分Table.3　The general nutritional composition of Schizothorax prenanti Tchang

一般認(rèn)為，魚肉中的水分含量高，則蛋白質(zhì)、脂肪含量將會(huì)減少，魚肉品質(zhì)就差；相反，魚肉水分含量低，則蛋白質(zhì)、脂肪含量就高，魚就肥嫩好吃[16]。由表3可知，大魚中水分含量高，但蛋白質(zhì)、脂肪含量低，而小魚、中魚水分含量低，脂肪、蛋白質(zhì)含量則高。溫安祥等[1]研究表明天然情況下，隨著魚體重的增長(zhǎng)，其水分、粗蛋白與灰分含量略有降低，但粗脂肪含量明顯增加，水分與粗脂含量與該結(jié)論相悖，這可能是受采樣的季節(jié)和樣品性別的影響。

2.1.2不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉pH及失水率的分析

魚被宰殺以后，肌肉在其內(nèi)部各種酶及外界微生物的作用會(huì)產(chǎn)生一系列的變化。正常肌肉在宰殺之前呈中性或者弱堿性，宰殺之后，糖原在缺氧的條件下酵解產(chǎn)生乳酸，pH則會(huì)降低。隨后，體內(nèi)的蛋白質(zhì)不斷分解，形成氨基酸、肽、蛋白胨等，又會(huì)引起pH回升，當(dāng)pH升至6.9以上時(shí)，肉會(huì)腐爛。如表4所示，魚被宰殺后，放置一段時(shí)間，測(cè)定pH，不同質(zhì)量齊口裂腹魚的pH無差異。表明魚的重量增長(zhǎng)對(duì)肌肉的pH沒有影響。

表4　齊口裂腹魚肌肉pH及失水率Table.4　The pH value and dehydration rate in muscle of Schizothorax prenanti Tchang

肌肉組織的持水力直接影響著肉的色、香、味、多汁性、嫩度等。失水率是反應(yīng)肌肉組織保持水分能力的一個(gè)重要指標(biāo)，失水率高，則大量液體外流，可溶性營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)就會(huì)損失，肌肉也會(huì)變得干硬無味，從而導(dǎo)致肉品質(zhì)降低。由表4可知小魚肌肉的失水率最低，而大魚的失水率最高。

2.1.3不同質(zhì)量齊口裂腹魚肌肉氨基酸組成分析氨基酸是蛋白質(zhì)的組成單元。如表5所示，除了在水解過程中色氨酸被破壞外，不同重量的齊口裂腹魚均檢測(cè)出了17種氨基酸，小魚肌肉干質(zhì)中總氨基酸含量、必需氨基酸含量以及鮮味氨基酸含量均高于中魚和大魚，且大魚中的氨基酸含量最低，各種氨基酸在三種不同體型魚中的分布相似，谷氨酸的含量最高，其次是天冬氨酸、賴氨酸，胱氨酸的含量最低。

表5　齊口裂腹魚肌肉氨基酸分析Table.5　The analysis of amino acid in muscle of Schizothorax prenanti Tchang

由于大魚肌肉的失水率高于中魚與小魚，而失水率高會(huì)造成可溶性營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失，因此大魚肌肉中的總氨基酸含量、鮮味氨基酸含量、必需氨基酸含量低于中魚，中魚低于小魚。肌肉中氨基酸的種類及分布與方靜等[17]對(duì)齊口裂腹魚肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析結(jié)果一致，但氨基酸含量稍低于其研究結(jié)果，這可能是由于氨基酸分析所用魚肉經(jīng)過解凍后處理所致。

2.2PPARγ在不同質(zhì)量齊口裂腹魚的不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

PPARγ在不同質(zhì)量齊口裂腹魚的不同組織中的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1　頭腎中PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.1　PPARγ gene expression level in head kidney

圖2　肌肉、肝臟中PPARγ mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.2　PPARγ gene expression level in muscle and liver

由圖1可知PPARγ在中魚頭腎中的表達(dá)量顯著（p＜0.05）高于在大魚、小魚中的表達(dá)量，在小魚中的表達(dá)量又顯著（p＜0.05）高于大魚中的表達(dá)量；由圖2可知PPARγ在肝臟與肌肉中的相對(duì)表達(dá)量，在大、中、小魚中有著顯著性差異（p＜0.05），在小魚肝臟與肌肉中PPARγ相對(duì)表達(dá)量顯著（p＜0.05）高于大、中魚，在中魚肝臟與肌肉中相對(duì)表達(dá)又顯著（p＜0.05）高于大魚中的相對(duì)表達(dá)量。

影響魚肌肉粗脂肪含量的因素很多，龔蘭[18]與Anna等[19]的研究表明，PPARγ的表達(dá)與體脂和肌內(nèi)脂肪含量呈一定的相關(guān)性。PPARγ能夠誘導(dǎo)小脂肪細(xì)胞的形成，調(diào)控脂蛋白酯酶、脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白、乙酰輔酶A、脂肪酸合成酶與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等的表達(dá)，抑制瘦素的表達(dá)。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在大、中、小魚頭腎中相對(duì)表達(dá)量的差異與魚肉中粗脂肪含量差異相同。頭腎是魚體重要的免疫器官，PPARγ可通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)的代謝通路來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，但調(diào)節(jié)機(jī)理目前尚不明確。PPARγ在中魚與小魚肝臟與肌肉中的相對(duì)表達(dá)量顯著（p＜0.05）高于在大魚中的相對(duì)表達(dá)量，這與中、小魚肉中的粗脂肪含量顯著（p＜0.05）高于大魚肉中的粗脂肪含量結(jié)果一致，表明PPARγ在組織中的相對(duì)表達(dá)量與肉質(zhì)中脂肪沉積可能存在正相關(guān)的關(guān)系，這與Meadus[20]、Tamori等[21]學(xué)者關(guān)于PPARγ與脂質(zhì)代謝的研究結(jié)果相似。

2.3PGC-1α在不同質(zhì)量齊口裂腹魚不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

圖3　頭腎中PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3　PGC-1α gene expression level in head kidney

圖4　肌肉、肝臟中PGC-1α表達(dá)量Fig.4　PGC-1α gene expression level in muscle and liver

由圖3可知，PGC-1α在大、中、小魚頭腎中的相對(duì)表達(dá)量有著顯著性差異（p＜0.05），在大魚中的相對(duì)表達(dá)量顯著（p＜0.05）高于中魚和小魚中的相對(duì)表達(dá)量，在小魚中的相對(duì)表達(dá)量又顯著（p＜0.05）高于中魚的相對(duì)表達(dá)量；而圖4則反映了PGC-1α在大、中、小魚肌肉與肝臟組織中的相對(duì)表達(dá)量無顯著性差異（p＞0.05）。

PGC-1α在大、中、小魚頭腎中的相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異，而在肌肉與肝臟中的相對(duì)表達(dá)量沒有顯著性差異，但可以看出PGC-1α在三個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量與魚肉中粗脂肪含量可能存在負(fù)相關(guān)系。PGC-1α可以促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化[22]，PGC-1α缺陷或表達(dá)量降低，長(zhǎng)鏈脂肪酸的氧化速率就會(huì)降低，線粒體的呼吸率就會(huì)下降，就會(huì)影響肥胖的發(fā)生。Koo等[23]將小鼠的PGC-1α敲出會(huì)表現(xiàn)出脂肪酸氧化能力下調(diào)，導(dǎo)致脂肪沉積，這與本研究的結(jié)論相似。

3　結(jié)論

通過對(duì)不同質(zhì)量的齊口裂腹魚肌肉品質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中、小魚肌肉中的蛋白質(zhì)、脂肪、鮮味氨基酸、必需氨基酸的含量高于大魚肌肉中的含量，而失水率低于大魚肌肉的失水率，因此齊口裂腹魚魚肉的品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與魚體生長(zhǎng)存在一定的關(guān)系，中、小體型齊口裂腹魚肌肉的品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于大魚；通過熒光定量PCR技術(shù)對(duì)齊口裂腹魚不同組織中的PPARγ、PGC-1α基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚組織中PPARγ、PGC-1α的相對(duì)表達(dá)量與肌肉中的粗脂肪含量存在著密切的聯(lián)系，PPARγ的相對(duì)表達(dá)量與肌肉粗脂肪含量可能存在正相關(guān)性，而PGC-1α的相對(duì)表達(dá)量與肌肉脂肪沉積可能存在負(fù)相關(guān)性，三者之間的關(guān)系及調(diào)節(jié)機(jī)理尚不完全明確，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證及深入研究。

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Analysis of muscle quality and the relative expression of PPARγ and PGC-1α in Schizothorax Prenanti Tchang

In this paper，the quality of muscle in Schizothorax prenanti Tchang of different weight was analyzed and the Real-time PCR was applied to explore the relative expression of PGC-1α and PPARγ of the fish in different tissue.The results showed that the content of protein and crude fat in Schizothorax prenanti Tchang of different weight were significant difference（p＜0.05）.The content of moisture and ash were revealed to be no significant difference（p＞0.05）.The pH value in muscle was no difference.The dehydration rate in big fish was higher than the medium and small fish.The contents of total amino acids，essential amino acids and the umami amino acids in small and medium fish were higher than the big one.The quality of muscle in small and medium fish was better than big one.The relative expression of PPARγ in the head kidney，liver and muscle of Schizothorax prenanti fish of different qualities was existed significant difference（p＜0.05）.The relative expression of PGC-1α in the head kidney existed significant difference（p＜0.05），and revealed no significant difference（p＞0.05）in liver and muscle.The expression of PPARγ and PGC-1α had a certain correlation with the crude fat in muscle.

Schizothorax prenanti Tchang；the quality of muscle；PPARγ；PGC-1α；relative expression

TS254.2

A

1002-0306（2015）04-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.030

2014－05－09

馮姣（1989-），女，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

鄔應(yīng)龍（1963-），男，博士，教授，研究方向：功能性食品。

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2009NZ007-007）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“211”工程雙支計(jì)劃（2013）。