尹秀華，王麗波，陶梅花，樊園絨，高升群，向仕輝，郭利軍

（大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理　671000）

常用抗菌藥物對(duì)常見(jiàn)致病菌L型誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)研究

尹秀華，王麗波，陶梅花，樊園絨，高升群，向仕輝，郭利軍*

（大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000）

目的：探討臨床常用抗菌藥物對(duì)常見(jiàn)致病菌L型的實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)作用，為臨床診治提供科學(xué)依據(jù)。方法：利用紙片彌散法和試管稀釋法，分別對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌進(jìn)行L型菌的抗菌藥物實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)。結(jié)果：頭孢唑林、頭孢哌酮、氨芐西林、哌拉西林、左氧氟沙星均可不同程度誘導(dǎo)銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌形成相應(yīng)的L型細(xì)菌，相同條件下金黃色葡萄球菌L型未誘導(dǎo)出。結(jié)論：部分抗菌藥物在一定條件下能使某些細(xì)菌失去細(xì)胞壁轉(zhuǎn)為L(zhǎng)型菌，繼而發(fā)生生物學(xué)性狀的改變，臨床診斷治療時(shí)應(yīng)給予重視。

抗菌藥物；細(xì)菌L型；實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)

［DOI］10．3969∕j．issn．1672-2345．2015．02．006

細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖結(jié)構(gòu)受到理化或生物因素的直接破壞或合成被抑制，這種細(xì)胞壁受損的細(xì)菌在高滲環(huán)境下仍可存活稱為細(xì)菌細(xì)胞壁缺陷型。因其首先在Lister研究院發(fā)現(xiàn)而得名細(xì)菌L型。目前不合理抗生素導(dǎo)致細(xì)菌失去細(xì)胞壁轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)型菌已經(jīng)成為某些疾病反復(fù)發(fā)作或遷延不愈的重要原因，人工誘導(dǎo)形成L型細(xì)菌的因素有很多〔1-2〕，如抗菌藥物、溶酶體等。本實(shí)驗(yàn)采用了6種臨床常用的抗菌藥物，在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)4種常見(jiàn)感染性致病菌進(jìn)行細(xì)菌L型誘導(dǎo)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料和方法

1．1材料

1．1．1菌種金黃色葡萄球菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27856、大腸埃希菌ATCC 25922、痢疾志賀菌，均由大理學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

1．1．2抗菌藥物頭孢唑林（哈藥集團(tuán)制藥，批號(hào)：H23020946）；頭孢哌酮（昆明積大制藥，批號(hào)：H20033229）；氨芐西林（山東魯抗醫(yī)藥，批號(hào)：H19993032）；哌拉西林（四川制藥，批號(hào)：H20061108）；左氧氟沙星（四川科倫藥業(yè)，批號(hào)：H20044291）；羅紅霉素膠囊（江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)，批號(hào)：H20055965）。

1．1．3藥敏試驗(yàn)紙片頭孢唑林（30 μg）、左氧氟沙星（30 μg）、羅紅霉素（15 μg）藥敏紙片，以上藥敏紙片均由北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司提供；氨芐西林（10 μg）、哌拉西林（100 μg）、頭孢哌酮（75 μg）3種抗菌藥物的紙片均按抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法制備〔3〕。

1．1．4培養(yǎng)基采用姜孝新〔4〕報(bào)道的改良細(xì)菌L型培養(yǎng)基L2型：優(yōu)質(zhì)蛋白胨20 g、牛肉膏30 g、氯化鈉50 g、蔗糖50 g、滅活小牛血清200 mL、1 mol∕L MgSO410 mL、蒸餾水800 mL、pH 7．4～7．6，固體培養(yǎng)基再加入瓊脂8 g。

1．2細(xì)菌L型的誘導(dǎo)

1．2．1方法L型菌固體瓊脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)法：采用藥物敏感試驗(yàn)紙片彌散法進(jìn)行誘導(dǎo)，逐日觀察抑菌圈內(nèi)及邊緣生長(zhǎng)物菌落形態(tài)及涂片革蘭染色細(xì)菌形態(tài)，連續(xù)2～3代出現(xiàn)典型L型菌落特征和∕或鏡下特征為誘導(dǎo)成功〔5〕；L型菌液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)法：在液體培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)采用試管稀釋法〔6-8〕，濃度選擇參考文獻(xiàn)〔9〕最小抑菌濃度判斷標(biāo)準(zhǔn)，起始濃度選用判斷為耐藥的最低濃度前移一個(gè)濃度。分別為：頭孢唑林（64 μg∕mL）、左氧氟沙星（16 μg∕mL）、羅紅霉素（4 μg∕mL），氨芐西林（大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌64 μg∕mL，金黃色葡萄球菌2 μg∕mL）、哌拉西林（大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌256 μg∕mL，金黃色葡萄球菌64 μg∕mL）、頭孢哌酮（128 μg∕mL）。采用藥敏試驗(yàn)試管稀釋法做6個(gè)濃度，設(shè)置一個(gè)不含抗菌藥物的對(duì)照，24 h后分別取各濃度培養(yǎng)液涂片革蘭染色油鏡檢查，連續(xù)觀察2～3 d。

1．2．2結(jié)果判定低倍鏡觀察L型菌落典型特征：“油煎蛋”狀、顆粒狀、絲狀菌落；革蘭染色油鏡下L型菌典型特征：多形性、巨球型、長(zhǎng)絲狀或長(zhǎng)桿狀；革蘭染色油鏡下出現(xiàn)典型特征為誘導(dǎo)成功。

2　結(jié)果

2．1細(xì)菌L型典型菌落的形成本次實(shí)驗(yàn)在細(xì)菌誘導(dǎo)2～3代過(guò)程中，在紙片彌散法抑菌圈內(nèi)或交界處發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌有細(xì)菌L型顆粒狀菌落、“油煎蛋”樣菌落，其余細(xì)菌菌落特征不明顯。見(jiàn)封三圖1～2。

2．2不同細(xì)菌形成L型菌落后的形態(tài)變化培養(yǎng)物涂片革蘭染色后鏡檢，可見(jiàn)長(zhǎng)桿狀、長(zhǎng)絲狀、球狀L型細(xì)菌典型特征；痢疾志賀菌、大腸埃希菌涂片后鏡下可見(jiàn)大量長(zhǎng)絲狀、少量支端膨大和串珠狀改變。見(jiàn)封三圖3～5。銅綠假單胞菌在平板法誘導(dǎo)中細(xì)絲狀改變。見(jiàn)封三圖6。稀釋法中為長(zhǎng)絲狀改變。見(jiàn)封三圖7。

2．3不同抗菌藥物兩種培養(yǎng)方法誘導(dǎo)產(chǎn)生L型菌結(jié)果見(jiàn)表1。

3　討論

多種細(xì)菌在某些理化因素作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)型，由于細(xì)菌細(xì)胞壁缺損，與原菌比較細(xì)菌L型形態(tài)、染色性質(zhì)、培養(yǎng)特性、生化反應(yīng)、耐藥性等生物學(xué)性狀發(fā)生改變，加之臨床癥狀不典型難以作出正確的診斷和治療。但是，多數(shù)細(xì)菌L型仍具有一定的致病能力，在機(jī)體免疫力降低時(shí)，影響因素減弱或消除后它又能恢復(fù)而使疾病復(fù)發(fā)、惡化。目前研究發(fā)現(xiàn)它可引起多種感染性疾病，如呼吸道感染、消化系統(tǒng)感染、泌尿系感染等，且由于轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)型菌后致病力降低易于被忽略〔4，10〕。而針對(duì)臨床感染性疾病而言，抗菌藥物則是引發(fā)細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)型的重要因素，本次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這一點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)中所使用的頭孢唑林、頭孢哌酮、氨芐西林、哌拉西林、左氧氟沙星、羅紅霉素都是目前常用的抗菌藥物，菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌也是常見(jiàn)引起臨床感染性疾病的病原體，除羅紅霉素之外的其余抗菌藥物都能使部分細(xì)菌發(fā)生L型轉(zhuǎn)變，其中大腸埃希菌和痢疾志賀菌能被頭孢唑林、頭孢哌酮、氨芐西林、哌拉西林、左氧氟沙星誘導(dǎo)產(chǎn)生L型菌，銅綠假單胞菌能被頭孢哌酮和哌拉西林誘導(dǎo)產(chǎn)生L型菌；以往研究多認(rèn)為影響細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗菌藥物是誘導(dǎo)產(chǎn)生L型菌的主要抗菌藥物，但本次實(shí)驗(yàn)中喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星也能誘導(dǎo)出大腸埃希菌和痢疾志賀菌的L型，而此類抗菌藥物目前廣泛應(yīng)用于臨床多系統(tǒng)的感染性疾病，需引起重視。金黃色葡萄球菌在本次實(shí)驗(yàn)中未誘導(dǎo)出L型，可能與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)，但研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌L型臨床較常見(jiàn)〔10〕，同樣應(yīng)引起重視。

表1　不同抗菌藥物兩種培養(yǎng)方法誘導(dǎo)產(chǎn)生L型菌

〔1〕Dienes L，Weinberger H J．The L-froms of bacteria〔J〕．Bacter-Ological Reviews，1951，15（4）:245-288．

〔2〕Allan E J，Hoischen C，Gumpert J．Bacterifal L-Forms〔M〕．San Diego:Elsevier Academic Press INC，2009．

〔3〕俞樹(shù)榮．微生物學(xué)和微生物學(xué)檢驗(yàn)〔M〕．北京：人民衛(wèi)生出版社，1997:452．

〔4〕姜孝新，楊祚升．改良細(xì)菌L型培養(yǎng)基的臨床應(yīng)用〔J〕．南華大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，29（5）:477-478．

〔5〕黃谷良，林特夫．細(xì)菌L型與疾病〔M〕．北京：學(xué)苑出版社，1991:49-60．

〔6〕倪語(yǔ)星，尚紅．臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)〔M〕．北京：人民衛(wèi)生出版社，2007:60-61．

〔7〕李楊，羅廷順，代欣桃，等．天南星提取物的抑菌作用研究〔J〕．大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，13（2）:9-11．

〔8〕耿玲，陳俊雅，李洪文，等．紫地榆提取物體外抗菌活性研究〔J〕．大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，13（10）:14-17．

〔9〕衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督中心衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)處．臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)匯編〔M〕．北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004:108-123．

〔10〕于守平，葛晨霞．細(xì)菌L型的形成機(jī)制與特性〔J〕．中國(guó)獸藥雜志，2009，43（8）:42-45．

（責(zé)任編輯李楊）

Experimental Study on Inductive Effects of Antibiotics on the Common Pathogenic L-form Bacteria

Yin Xiuhua,Wang Libo,Tao Meihua,Fan Yuanrong,Gao Shengqun,Xiang Shihui,Guo Lijun*
（College of Public Health,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China）

Objective:To explore laboratory inductive effects of the commonly used clinical antibiotics on the common pathogenic L-form bacteria and to provide a scientific basis for clinical diagnosis and treatment．Methods:With the paper dispersion method and tube dilution method,Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa,E.coli and Shigella were induced by antibiotics in the laboratory．Results:Cefazolin,cefoperazone,ampicillin,piperacillin and levofloxacin could induce Pseudominas aeruginosa,E.coli and Shigella to some degree to form corresponding L-form bacteria．L-form Staphylococcus aureus under the same condition wasn′t induced．Conclusion:Some antibiotics under certain conditions could make some bacteria lose cell walls and become L-form bacteria,and then change their biological characteristics,which the clinical diagnosis and treatment should attach importance to．

antibiotics;L-form bacteria;the laboratory induction

R37

A

1672-2345（2015）02-0021-03

大理學(xué)院大學(xué)生科研基金資助項(xiàng)目（KYSX2013005）

2014-10-05

2014-11-25

尹秀華，預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2010級(jí)本科生．

郭利軍，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師．