馬薩日娜 張美莉 付 媛 烏云達(dá)來 斯琴其木格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，呼和浩特 010018）（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院2，呼和浩特 010018）

裸燕麥谷蛋白酶解物的純化及其清除自由基活性研究

馬薩日娜1張美莉1付 媛2烏云達(dá)來1斯琴其木格1

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，呼和浩特 010018）（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院2，呼和浩特 010018）

利用堿性蛋白酶對(duì)裸燕麥谷蛋白進(jìn)行酶解，采用超濾及離子交換層析對(duì)酶解物進(jìn)行純化，然后考察各分離組分清除·OH、DPPH·能力。結(jié)果表明：超濾法分離裸燕麥谷蛋白酶解物所得的5個(gè)組分中，組分Ⅰ清除·OH能力最強(qiáng)。其質(zhì)量濃度為3 mg／mL時(shí)清除·OH能力高于90%。進(jìn)一步對(duì)組分Ⅰ離子交換分離，所得的4個(gè)組分中，組分 D清除·OH（IC501.532 mg／mL）、清除DPPH·（IC501.278 mg／mL）能力高于其他3個(gè)組分。分離組分D為堿性氨基酸，清除·OH與DPPH·能力都強(qiáng)于裸燕麥谷蛋白酶解物。

裸燕麥 谷蛋白 酶解 純化 自由基

具備特殊生理功能的肽類稱之生物活性肽（bioactivity peptides），除易消化吸收，還具有人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能。如提高免疫、激素調(diào)節(jié)、降血壓、降血脂、抗疲勞、抗病毒、抗氧化等作用，使其成為國(guó)際醫(yī)藥界及食品界熱門的研究課題和發(fā)展前景廣闊的功能因子。由于自由基攻擊細(xì)胞壁和大分子物質(zhì)，引起機(jī)體病變和損傷，從而加速機(jī)體衰老［1－2］。正常生理狀況下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基與清除自由基處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但其機(jī)體在不良環(huán)境或隨年齡的增長(zhǎng)，體內(nèi)產(chǎn)生過多自由基或清除過慢。自由基清除劑別名為抗氧化劑，能清除使體內(nèi)失衡的自由基，從而減輕機(jī)體承受的損傷。

抗氧化肽在植物蛋白中的研究較多。Chen等［3］、榮建華［4］、徐力等［5］都從大豆蛋白中分離出具有抗氧化活性的多肽。程云輝等［7］考察了麥胚抗氧化肽。文獻(xiàn)［8－10］對(duì)蕎麥球蛋白、清蛋白及裸燕麥球蛋白提取物進(jìn)行了清除自由基研究并證實(shí)其具有一定抗氧化活性。

燕麥蛋白被證明具有良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性。裸燕麥蛋白質(zhì)中，除含量最高的球蛋白，谷蛋白含量（20%～25%）［11］也相對(duì)較高。本試驗(yàn)對(duì)酶解的裸燕麥谷蛋白進(jìn)行分離純化，研究清除·OH和DPPH·活性較強(qiáng)的肽段，以期為進(jìn)一步開發(fā)利用裸燕麥谷蛋白資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥，貯藏于0～4℃。

732強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂：江蘇臨海樹脂有限公司；堿性蛋白酶：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；1，1－二苯基 －2－三硝基苯肼（DPPH·）：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外－可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；冷凍干燥機(jī)FD－2、核酸蛋白層析儀：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；層析柱（2.6 cm ×60 cm）：上海錦華層析設(shè)備廠；高速冷凍離心機(jī)H2500R－2：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；超濾離心管：Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 裸燕麥谷蛋白的制備及其酶解工藝

裸燕麥經(jīng)去殼、脫毛、磨粉、脫脂后，采用 Osborne法制備裸燕麥谷蛋白。

酶解裸燕麥谷蛋白的工藝流程如圖1所示。

圖1 裸燕麥谷蛋白酶解的工藝流程

1.3.2 超濾離心法分離純化裸燕麥谷蛋白酶解物

采用截留分子質(zhì)量（MWCO）分別為30、10、5和3 ku的超濾管對(duì)裸燕麥谷蛋白酶解液進(jìn)行分級(jí)分離。收集所得組分Ⅰ（＞30 ku）、Ⅱ（10～30 ku）、Ⅲ（5～10 ku）、Ⅳ（3～5 ku）、Ⅴ（＜3 ku），并將各組分凍干后測(cè)其清除·OH與DPPH·的能力。

1.3.3 離子交換層析純化裸燕麥谷蛋白酶解物

1.3.3.1 離子交換樹脂預(yù)處理

1）用水浸泡2～3 h，用去離子水洗至出水澄清，除去雜質(zhì)，再傾去水。

2）加入2倍體積2%NaOH溶液，攪拌4 h。

3）除去堿液，水洗至pH 8～10.

4）加入2倍體積4%鹽酸溶液，攪拌4 h。

5）除去酸液，水洗至中性，此時(shí)樹脂已轉(zhuǎn)為H型。

1.3.3.2 離子交換層析純化酶解物

將超濾所得的清除自由基活性最強(qiáng)的組分溶于醋酸氨緩沖液（pH 4.5）配制成質(zhì)量濃度為24 mg／mL的溶液。將選型后的離子交換樹脂裝柱（柱尺寸：2.6 cm×60 cm），用pH 4.5的醋酸氨緩沖液平衡柱子12 h后上樣，以0.2 mol／L氨水等速（1.0 mL／min）洗脫，并用分步收集器收集洗脫液（4 mL／管），于220 nm下檢測(cè)吸光值，將屬于同一峰的收集液混合，凍干后分析其清除·OH與DPPH·的能力。

1.4 裸燕麥谷蛋白酶解物清除自由基活性測(cè)定

1.4.1 對(duì)·OH清除作用的測(cè)定

［12］方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 對(duì)DPPH·清除作用的測(cè)定

參考文獻(xiàn)［13］的方法，并有所改進(jìn)。

試劑配置：用無水乙醇溶解9.858 mg DPPH·并定容至25 mL棕色容量瓶中，配成1 mmol／L的溶液，冷藏放置，用時(shí)用無水乙醇稀釋10倍成0.1 mmol／L的溶液。

方法：將2 mL超純水和2 mL樣品分別加入等體積DPPH·無水乙醇溶液（0.1 mmol／L），充分蕩使其溶解于室溫下反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)OD值，得到A0和A1。A2由2 mL樣品加入等體積無水乙醇測(cè)定：

2 結(jié)果與分析

2.1 裸燕麥谷蛋白酶解粗提物的清除自由基能力

裸燕麥谷蛋白酶解粗提物清除·OH、DPPH·作用如圖2所示，酶解物對(duì)2種自由基的清除率隨其終質(zhì)量濃度的增加呈二次曲線上升趨勢(shì)。清除·OH、DPPH·的 IC50分別為3.933、2.318 mg／mL。

圖2 裸燕麥谷蛋白酶解物清除自由基能力

2.2 超濾分離后各組分清除自由基活性比較

裸燕麥谷蛋白水解物經(jīng)超濾獲得＞30、10～30、5～10、3～5 ku和＜3 ku的5個(gè)分子質(zhì)量肽段的組分，將這5種組分的蛋白質(zhì)酶解物質(zhì)量濃度分別調(diào)整到3 mg／mL測(cè)定·OH清除率，重復(fù)3次，結(jié)果如表1所示。從表1可知，分子質(zhì)量30 ku以上的組分Ⅰ對(duì)·OH清除能力最強(qiáng)，而分子質(zhì)量＜3 ku的肽段清除能力最弱。這與Eun－Kyung等［14］對(duì)厚殼貽貝酶解物的研究結(jié)果相似，研究認(rèn)為經(jīng)超濾得到分子質(zhì)量30 ku以上的組分·OH清除能力最強(qiáng)。但與一些研究者得出的分子質(zhì)量＜3 ku的肽段具有更強(qiáng)的·OH清除活性不同［3，8］。

表1 超濾分離后谷蛋白酶解物各組分的羥自由基清除活性

2.3 離子交換層析純化

將超濾得到的組分Ⅰ用醋酸氨（pH 4.5）溶解后，上樣到732強(qiáng)酸型陽離子柱進(jìn)行分離，結(jié)果如圖3所示，組分Ⅰ被進(jìn)一步分離成 A、B、C、D 4個(gè)組分。其中組分A的保留時(shí)間最短，說明不容易被陽離子樹脂吸附，表明這部分肽段組成是酸性氨基酸。而組分D的保留時(shí)間最長(zhǎng)，容易被陽離子樹脂吸附，這說明組分D是堿性氨基酸［15］。

圖3 離子交換層析分離純化組分Ⅰ的結(jié)果

2.4 離子交換層析純化后各組分清除自由基能力比較

離子交換層析純化后的各組分清除·OH活性的結(jié)果如圖4所示，組分D的清除率最強(qiáng)，其清除·OH的 IC50值為1.532 mg／mL，而組分 A清除·OH的IC50值為2.399 mg／mL，組分C和組分 B清除能力不強(qiáng)。

圖5為各組分清除DPPH·活性結(jié)果，組分D清除DPPH·的IC50值為1.278 mg／mL，而組分A清除DPPH·的IC50值為2.098 mg／mL，組分D的清除活性仍比組分A強(qiáng)，組分C和組分B清除能力相對(duì)較弱。通過離子交換層析推測(cè)組分D是堿性氨基酸，一般認(rèn)為，堿性氨基酸比中性和酸性氨基酸具有更強(qiáng)的抗氧化性。如 Chen等［3］從大豆蛋白水解物中分離出來的 VNPHDHQN、LLPHH、LVNPHDHQN、LLPHHADADY和 LNSGDALRVPSGTTYY等肽段。Tsuge等［16］從蛋清水解物中分離出來的 AH、VHHANEN和VHH等肽段，都發(fā)現(xiàn)堿性氨基酸具有更強(qiáng)的抗氧化性。

圖5 離子交換純化后各組分DPPH·清除能力

2.5 裸燕麥谷蛋白酶解物、離子交換各分離組分清除自由基能力比較

由表2可知，對(duì)·OH和DPPH·的清除作用順序均表現(xiàn)為：分離組分D＞分離組分A＞谷蛋白酶解物。

表2 裸燕麥谷蛋白酶解物及其分離組分的IC50／mg／mL

3 結(jié)論

3.1 采用超濾法分離裸燕麥谷蛋白酶解物，得到組分Ⅰ清除·OH的能力最強(qiáng)。其質(zhì)量濃度為3 mg／mL的·OH清除率達(dá)90%。組分Ⅰ的分子質(zhì)量在30 ku以上。

3.2 選用強(qiáng)酸型陽離子樹脂732對(duì)組分Ⅰ分離結(jié)果顯示，組分D是堿性氨基酸，其清除·OH的能力（IC501.532 mg／mL）大于酸性組分 A（IC502.399 mg／mL），組分 D清除 DPPH·的能力（IC501.278 mg／mL）也大于組分A（IC502.098 mg／mL）。表明堿性組分具有較強(qiáng)抗氧化活性。

3.3 通過離子交換層析純化獲得的組分D清除·OH與DPPH·能力較裸燕麥谷蛋白酶解粗提物清除作用都有大幅度提高，因此進(jìn)一步明確組分D的分子質(zhì)量大小和肽的氨基酸序列是本研究亟待深入的問題。

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Purification of Free Radical Scavenging Peptides from Naked Oats Glutelin by Enzymatic Hydrolysis

Ma Sarina1Zhang Meili1Fu Yuan2Wuyundalai1Siqinqimuge1

（College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University1，Huhehaote 010018）（College of Sciences，Inner Mongolia Agricultural University2，Huhehaote 010018）

Naked oats glutelin has been hydrolyzed by alkaline protease in the paper.Ultrafiltration and ionexchange column chromatography have been utilized to isolate and purify the naked oats glutelin peptide.The results showed that hydroxyl free radical scavenging activity of component I was the strongest among the total 5 components detected by ultrafiltration separation process.On condition of the mass concentration of 3 mg／mL，scavenging effect against·OH reached a higher value of more than 90%.Component I was further purified into 4 fractions by ion－exchange column chromatography.Fraction D showed a higher scavenging effect against·OH（IC501.532 mg／mL），DPPH·（IC501.278 mg／mL）than the other 3 fractions.Moreover，fraction D was basic amino acids，which had exhibited a higher scavenging effect against hydroxyl and a better DPPH eliminating radical ability than that of the naked oats glutelin hydrolysates.

naked oats，glutelin，enzymatic hydrolysis，purification，free radical

TS217.1

A

1003－0174（2015）09－0045－04

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金（2013MS1221），國(guó)家自然科學(xué)基金（30960240），內(nèi)蒙古自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新資助項(xiàng)目（B20131012911）

2014－04－10

馬薩日娜，女，1984年出生，博士，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程

張美莉，女，1966年出生，教授，博士生導(dǎo)師，植物生物活性成分的分離提取及農(nóng)產(chǎn)品加工