陳 容，張黨權(quán)，鄭玉娟，龔建平，陳麗莉，周文化，何含杰，覃杰明

（1.中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室； b.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室；c.經(jīng)濟林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004；2.湖南省澧縣樹大園林有限公司，湖南 澧縣 415513）

紅檵木腋芽高效快繁研究

陳 容1a-c，張黨權(quán)1a-c，鄭玉娟1a-c，龔建平2，陳麗莉1a-c，周文化1a-c，何含杰1a-c，覃杰明1a-c

（1.中南林業(yè)科技大學 a.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室； b.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室；c.經(jīng)濟林培育與利用湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410004；2.湖南省澧縣樹大園林有限公司，湖南 澧縣 415513）

為給紅檵木組織培養(yǎng)與工廠化育苗提供技術(shù)參考，分別以紅檵木2年生莖段和當年生莖段為外植體，通過優(yōu)化紅檵木腋芽的叢生芽誘導與增殖、生根與移栽方案，最終建立了以腋芽為基礎(chǔ)的紅檵木高效快繁體系。結(jié)果表明：紅檵木莖段腋芽叢生芽誘導與增殖的最佳培養(yǎng)基配方分別為MS＋6-BA 1.3mg/L＋NAA 0.2mg/L和MS＋6-BA 1.2mg/L＋IBA 0.07mg/L＋Vc 5.0mg/L；叢生芽生根的最佳培養(yǎng)方案為：選取高度在1.0～3.0cm之間的植株，將其接種到3/4MS＋IBA 4mg/L 的培養(yǎng)基當中；生根組培苗的最佳移栽方案為：煉苗1周后，將其移栽到珍珠巖∶蛭石∶腐殖土＝1∶1∶3的基質(zhì)中。

紅檵木；腋芽；叢生芽；高效快繁

紅檵木又稱紅花檵木Loropetalum chinensevar.rubrum，為金縷梅科檵木屬植物。紅檵木最初是從湖南省瀏陽市大圍山引種而來的野生植株，并被鑒定為檵木的變種[1]，發(fā)展至今已有近百年的栽培歷史。紅檵木具有生態(tài)適應(yīng)能力強、顏色艷麗、花期長、耐修剪、易造型等優(yōu)點，且具有很高的觀賞價值。開展紅檵木組織培養(yǎng)的研究，特別是紅檵木再生技術(shù)、快繁技術(shù)的研究，有助于紅檵木的工廠化育苗與轉(zhuǎn)基因應(yīng)用。為給紅檵木組培工廠化育苗與轉(zhuǎn)基因研究提供技術(shù)參考，本項目組已建立紅檵木愈傷組織高效再生體系[2]，同時開展以紅檵木莖段為外植體，對其腋芽的叢生芽誘導、增殖、生根及生根叢生芽的移栽方案進行優(yōu)化，以建立高效的紅檵木快繁體系。

1 材料與方法

1.1 外植體的表面滅菌

采取含有多個腋芽的紅檵木短枝條，去除葉片，洗凈后進行表面消毒處理。由于紅檵木莖段的木質(zhì)化程度不同，其表面攜帶的微生物量也有較大的差異，故表面消毒時間的長短也大不相同。分別選取當年生和2年生的紅檵木莖段作為外植體，先用75%的酒精處理45 s，再分別用適量的0.1%和0.2%的升汞進行2次消毒處理，消毒處理方式與處理結(jié)果見表1。消毒完畢后，將外植體用0.1 mol/L的氯化鈣溶液浸泡處理1 min。

1.2 腋芽誘導叢生芽

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計了9組分別含有不同濃度6-BA和NAA植物激素的腋芽誘導叢生芽培養(yǎng)基（見表2）。將表面消毒后的紅檵木枝條切成長為1.5cm、帶有1～2個腋芽的莖段，接種至腋芽誘導叢生芽培養(yǎng)基中，每組接種50個莖段，于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d，一個月后統(tǒng)計各試驗組的出芽情況。

1.3 叢生芽的增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計25組分別含有不同濃度6-BA和IBA植物激素的叢生芽增殖培養(yǎng)基（見表3）。將新長出的腋芽切下，轉(zhuǎn)入?yún)采吭鲋撑囵B(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d，觀察并記錄叢生芽的生長情況。

1.4 叢生芽的壯苗培養(yǎng)

叢生芽在增殖培養(yǎng)過程中其莖稈往往較細，不利于生根移栽，因此需要將叢生芽轉(zhuǎn)入不含激素的MS培養(yǎng)基中進行壯苗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d，待植株長到一定高度后再進行生根誘導培養(yǎng)。

1.5 叢生芽的生根誘導

將在壯苗培養(yǎng)基中生長良好的紅檵木小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，設(shè)計10組以1/2MS和3/4MS為基本培養(yǎng)基、含有不同濃度IBA的生根培養(yǎng)基（見表4）。先在黑暗條件下培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為12 h/d。接種30 d后，統(tǒng)計各生根植株的株高、根數(shù)、最長根長及最短根長。

1.6 組培苗的移栽

將含有生根植株的培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)入室外，旋松瓶口使其逐漸適應(yīng)外界的溫度和光照，一周之后取出紅檵木小苗，先放入含有0.1%的多菌靈稀釋液中進行消毒處理，用清水清洗后再轉(zhuǎn)入苗盤中，苗盤中鋪滿經(jīng)高溫滅菌冷卻后的基質(zhì)，該基質(zhì)的成分為腐殖土∶蛭石∶珍珠巖＝3∶1∶1。接種完后用透明塑料薄膜蓋住苗盤，并定期給紅檵木小苗噴施葉面肥，30 d后統(tǒng)計其存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅檵木腋芽的高效表面滅菌

外植體接種培養(yǎng)15 d后，分別對不同處理的莖段進行觀察，并統(tǒng)計相應(yīng)的污染率、褐化率及存活率，結(jié)果見表1。表1表明，選用當年生莖段作為外植體的消毒效果比2年生莖段的消毒效果要好。經(jīng)2次HgCl2消毒處理后，以0.1% HgCl2處理后的污染率比0.2% HgCl2的高，但其褐化率卻比0.2% HgCl2的低，并且消毒時間過長或過短都不能達到有效控制污染率和褐化率的效果。因此，紅檵木外植體的高效表面消毒處理方案為：采用當年生的幼嫩莖段，以75%的酒精漂洗外植體45 s，然后以0.1%的 HgCl2消毒2次，每次消毒處理3 min。

2.2 紅檵木叢生芽的高效誘導

將消毒后的紅檵木幼嫩莖段轉(zhuǎn)入?yún)采空T導培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)1周后開始出芽，其狀態(tài)如圖1A所示，一個月后統(tǒng)計各個不同激素組合處理的出芽情況，結(jié)果如表2。由表2可知，紅檵木叢生芽的誘導率最高可達86%，因此，最高效的叢生芽誘導培養(yǎng)基為：MS＋6-BA 1.3mg/L＋ NAA 0.2mg/L。

2.3 紅檵木叢生芽的高效增殖

將誘導出的叢生芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，定期觀察并記錄叢生芽的出芽天數(shù)、增殖系數(shù)和產(chǎn)生愈傷組織的情況，結(jié)果分別如圖1B和表3所示。分析結(jié)果表明，較高的6-BA濃度能夠促進叢生芽的產(chǎn)生，叢生芽的最短出芽時間為14 d，而高濃度的 6-BA和IBA相互作用的結(jié)果是能極大提高叢生芽的增殖系數(shù)，其增殖系數(shù)最高可達15.00；同時，當叢生芽增殖情況較好時其產(chǎn)生的愈傷組織相對較少，當叢生芽增殖較慢或較少時則愈傷組織會大量產(chǎn)生。因此，紅檵木叢生芽的高效增殖培養(yǎng)基為：MS＋6-BA 1.2mg/L＋IBA 0.07mg/L＋Vc 5.0mg/L。

表1 紅檵木外植體表面消毒處理方式與處理結(jié)果Table 1 Method and result of surface disinfection of explants in L. chinense var. rubrum %

表2 不同激素組合的培養(yǎng)基對紅檵木叢生芽的誘導情況Table 2 Induction status of multiple shoots in L. chinense var. rubrum under different hormone combinations

2.4 紅檵木叢生芽的高效生根

將叢生芽接種至生根培養(yǎng)基中進行生根誘導，對接種時及生根誘導一個月后叢生芽生根植株的株高進行統(tǒng)計，結(jié)果分別見表4和表5。根據(jù)對生根植株的數(shù)量、根數(shù)、最短根長和最長根長等指標的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，得到最佳生根激素配比方案（表6），并了解到生根誘導過程中植株的生長變化情況和生根數(shù)量與平均最長根長和最短根長之間的關(guān)系（表7）。

由表4可知，叢生芽的高度在1.0～3.0cm之間時其更容易生根，此類叢生芽占其總數(shù)的80.07%；而高于不能生根的株高為4.0cm的叢生芽所占百分比。低濃度的IBA更能促進株高為0.0～2.0cm的植株生根；而當IBA的濃度大于3mg/L時，2.0cm以上植株的生根率更高。同時，在相同的激素濃度下，3/4MS的培養(yǎng)基更能促進3～4cm高的植株生根。

由表4可知，在生根誘導30天后，植株高度仍然集中在1.0～3.0cm之間，此類植株占其總數(shù)的73%；但是，0.0～1.0cm高的植株所占百分比卻減少了，4.0cm以上的植株僅占其總數(shù)的6%，而株高為3.0～4.0cm的植株所占百分比也增加了5%。這一結(jié)果充分說明，叢生芽在生根的過程中伴有植株長高的現(xiàn)象。

由表6可知，高濃度IBA的生根率高，低濃度IBA的生根率低，當IBA濃度達到4mg/L時，生根率最高可達82%；而1/2MS 和3/4MS對紅檵木叢生芽生根率的影響都不大。

由表7可知，根數(shù)與根長之間存在密切的聯(lián)系。當根數(shù)為偶數(shù)時，最長根長均值均大于1cm；當根數(shù)達到10條以上時，其最長根長均值最大。而根數(shù)對最短根長均值的影響情況如下：當根數(shù)在10條以下時，最短根長均值的變化不大，在0.27cm上下浮動；而當根數(shù)達到10條時，最短根長均值達到0.5cm，但是，當根數(shù)超過10條時，最短根長均值又開始變小，回到0.21cm。

表3 紅檵木叢生芽的高效增殖情況Table 3 High-efficient multiplication status of multiple shoots in L. chinense var. rubrum

表4 剛接種時不同株高的生根叢生芽占其總數(shù)的百分比Table 4 Rooting rate of multiple buds at different heights after inoculated

表5 接種30 d后不同株高的生根叢生芽占其總數(shù)的百分比Table 5 Rooting rate of multiple buds at different heights after inoculated 30 days

表6 紅檵木叢生芽在不同激素和培養(yǎng)基組合下的生根率Table 6 Rooting rate of multiple buds in L. chinense var. rubrum under different hormone and medium combinations

綜上所述，紅檵木叢生芽的高效生根培養(yǎng)方案為：選取高度在1.0～3.0cm之間的植株，將其接種到3/4MS＋IBA 4mg/L 的培養(yǎng)基當中。

表7 紅檵木生根不定芽的根數(shù)與根長的關(guān)系Table 7 Relationship of root number and root length of rooting adventitious buds in L. chinense var.rubrum

2.5 紅檵木組培苗的高效移栽

對生長狀況良好的生根叢生芽進行煉苗，并將其移栽到珍珠巖∶蛭石∶腐殖土= 1∶1∶3的基質(zhì)中，一個月后仍能夠很好地生長，其生長狀態(tài)如圖1D所示，其存活率達到80%以上。

3 結(jié)論與討論

3.1 影響腋芽誘導叢生芽的因素分析

圖1 高效快繁紅檵木的生長狀態(tài)Fig. 1 Growth status of L. chinense var. rubrum in the high-ef fi cient and rapid propagation system

影響腋芽誘導叢生芽的因素主要來源于腋芽的活性和外源激素的類型及濃度的大小。在外植體的選取過程中，2年生莖段的木質(zhì)化程度比當年生莖段的木質(zhì)化程度要大，表面消毒困難，誘導產(chǎn)生叢生芽所需時間更長；而當年生莖段對升汞更加敏感，消毒時間短而且腋芽啟動時間較短。此外，外植體的取材時間和所選莖段的部位對腋芽的萌動也有較大的影響[3-4]。實驗中發(fā)現(xiàn)，初春時采取的外植體更容易出芽，出芽時間最短的只需3 d就能長出新芽，而在其他時間采取的外植體其萌發(fā)時間都在1周以上。將來源于同一枝條的莖尖和莖段同時接種到同一組培瓶中，莖段更容易長出叢生芽。這一結(jié)果與吳向明[5]研究的結(jié)果相似。能促進腋芽產(chǎn)生叢生芽的外源激素主要是6-BA[6]， 6-BA和NAA的協(xié)同作用[7]也能促進腋芽產(chǎn)生叢生芽。實驗中還發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，6-BA對腋芽的促進作用不大，但其與低濃度NAA的相互作用卻能使叢生芽的誘導率有較大的波動。因此，最高效的叢生芽誘導培養(yǎng)基可選為：MS＋6-BA 1.3mg/L＋NAA 0.2mg/L。

3.2 影響叢生芽增殖的因素分析

叢生芽的增殖主要受外源激素種類和濃度的控制，6-BA能夠促進不定芽的形成和增殖，但是高濃度的6-BA會使器官的穩(wěn)定分化能力下降[8]，并且6-BA長時間對植物外植體的作用也會促進酚類化合物的合成，刺激多酚氧化酶的活性，從而導致愈傷組織易發(fā)生褐變而死亡。因此，尋找到合適的6-BA的濃度及適當添加Vc[9]、PVP[10]等抗氧化劑能有效改善這些情況。同時，由于6-BA與IBA的協(xié)同作用效果明顯優(yōu)于6-BA 與NAA的協(xié)同作用效果[11]，因此，在紅檵木叢生芽的增殖培養(yǎng)實驗中，選用了低濃度的IBA與6-BA，設(shè)計了25個激素組合，最終得到的紅檵木叢生芽高效增殖的培養(yǎng)基為：MS＋6-BA 1.2mg/L＋IBA 0.07mg/L＋Vc 5.0mg/L。

3.3 影響叢生芽生根的因素分析

影響叢生芽生根的因素，除了培養(yǎng)基的類型和外源激素的種類及濃度外，還有叢生芽的株高和叢生芽增殖培養(yǎng)的時間。實驗結(jié)果證明，IBA的濃度對生根有很大影響[12]，高濃度IBA的生根率高，而低濃度IBA的生根率低。當培養(yǎng)基為3/4MS 、IBA濃度達到4mg/L時，生根率最高可達82%。同時，在接種時選擇高度在1.0～3.0cm之間的叢生芽，其更容易生根，因此，增殖培養(yǎng)的時間不能過長。增殖培養(yǎng)的時間越長植株越高，木質(zhì)化程度越高，就越不容易生根，進而影響生根的數(shù)量和根的活性。

3.4 影響組培苗移栽成活率的因素分析

由于叢生芽是長時間生長在無菌和恒溫的環(huán)境中的，將其突然轉(zhuǎn)入自然環(huán)境中生長便很難存活，所以煉苗階段顯得尤為重要。煉苗時逐步旋松瓶口，讓叢生芽逐漸適應(yīng)外界的空氣和溫度，移栽后成活率會大幅提高。同時，生長基質(zhì)的成分和配比對根的生長也有重要影響，實驗結(jié)果證明，蛭石∶珍珠巖∶腐殖土＝ 1∶1∶3的基質(zhì)很適合叢生芽根的進一步生長。除此之外，生根誘導培養(yǎng)時間的長短和移栽后期的水肥管理對移栽成活率也會有較大的影響。實驗中發(fā)現(xiàn)，生根誘導培養(yǎng)超過2個月后，叢生芽的根尖開始逐步變黑直到整個根部褐化失去活性，這樣的叢生芽移栽后其成活率極低。而不定芽在移栽后仍然十分脆弱，其葉片容易失水，若不能及時補充水肥，也很難保證移栽苗的成活率。因此，煉苗處理、基質(zhì)的成分、叢生芽生根誘導培養(yǎng)時間的長短及后期的水肥管理都是影響組培苗成活率的關(guān)鍵因素。

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High-ef fi cient and fast propagation of axillary buds inLoropetalum chinensevar.rubrum

CHEN Rong1a-c, ZHANG Dang-quan1a-c, ZHENG Yu-juan1a-c, GONG Jian-ping2, CHEN Li-li1a-c, ZHOU Wen-hua1a-c,HE Han-jie1a-c, QIN Jie-ming1a-c
(1.a. Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, Ministry of Education; b. Hunan Provincial Key Laboratory of Forestry Biotechnology; c. Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Hunan Lixian Shuda Garden Co. Ltd., Lixian 415513, Hunan, China)

In order to provide a technical reference for tissue culture and factory seedling ofLoropetalum chinensevar.rubrum, using biennial and annual stems as explants, the high-ef fi cient and fast propagation system ofL. chinensevar.rubrumwas established, through optimizing the protocol of induction, multiplication, rooting and transplanting of multiple shoots of axillary bud inL. chinensevar.rubrum.The results showed that the optimal mediums for multiple shoots induction and multiplication were MS＋6-BA 1.3mg/L＋NAA 0.2mg/L and MS＋6-BA 1.2mg/L＋IBA 0.07mg/L＋Vc 5.0mg/L, respectively. The optimal program for rooting of multiple shoots was choosing the buds at 1.0-3.0cm height and inoculating to the medium of 3/4 MS＋IBA 4mg/L. And the optimal program for transplanting of rooting tissue culture seedling was domesticating the buds for a week and then transplanting them into a kind of matrix with perlite, vermiculite and humus soil (1∶1∶3).

Loropetalum chinensevar.rubrum; axillary buds; multiple shoots; high-ef fi cient and fast propagation

S687

A

1003—8981(2015)04—0096—06

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.04.017

2014-10-31

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201204610）；湖南省科技計劃重點項目（2014FJ2004）。

陳 容，碩士研究生。

張黨權(quán)，教授，博士，博士研究生導師。E-mail：zhangdangquan@163.com

陳 容,張黨權(quán),鄭玉娟,等.紅檵木腋芽高效快繁研究[J].經(jīng)濟林研究,2015,33(4)：96－101.

[本文編校：伍敏濤]