朱曉峰，劉宏軍，席軍強，孟文生，裴艷紅

（1.甘肅省張掖市林木種苗管理站，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省平涼市關山林業(yè)管理局，甘肅 平涼 744100）

枸杞根腐病病原菌的生物學特性研究

朱曉峰1，劉宏軍1，席軍強2，孟文生1，裴艷紅1

（1.甘肅省張掖市林木種苗管理站，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省平涼市關山林業(yè)管理局，甘肅 平涼 744100）

為給枸杞根腐病的有效防治提供科學依據(jù)，以甘肅省內枸杞主產區(qū)枸杞根腐病病株中分離鑒定的單隔鐮孢菌為研究對象，對其在不同培養(yǎng)基、溫度、光照、pH值、碳源和氮源上的生長狀態(tài)與特性進行了觀測與分析。結果表明：適于單隔鐮孢菌生長的最適培養(yǎng)基為豆芽汁培養(yǎng)基；最適宜的溫度范圍為15～35 ℃，最適溫度為35 ℃；適宜的pH值范圍為4～10，最適的pH值為9；供試的4種碳源均能被其利用，其中以乳糖的利用效果為最好；該菌株能夠利用供試的4種氮源，其對硫酸銨的利用效果最差；光暗交替的培養(yǎng)環(huán)境有利于菌絲生長，而連續(xù)黑暗的培養(yǎng)環(huán)境卻能抑制菌絲生長。

枸杞；根腐??；病原菌；生物學特性

枸杞Lycium bararumL.為茄科多年生落葉灌木，是重要的藥食兩用經濟植物資源，具有耐鹽堿、耐寒、抗旱、抗熱、適應性強等特性，也是治理荒漠化土地的生態(tài)樹種[1-2]。近幾年，隨著枸杞種植效益的提高，甘肅省白銀市枸杞種植規(guī)模不斷擴大，并集中形成了靖遠縣靖安、五合、東升和北灘及景泰縣草窩灘多處枸杞優(yōu)勢產區(qū)，枸杞多種病害的發(fā)生也逐年加重，防控難度進一步加大[3]。枸杞根腐病是一種系統(tǒng)感染病害，病株的根和根頸部腐爛，莖稈維管束變褐色。枸杞根腐病病原菌為4種鐮孢菌，即尖孢鐮孢菌F.oxysporum、茄病鐮孢菌F.solani、同色鐮孢菌F.concolor和串珠鐮孢菌F. moniliforme，其中致病力最強的是尖孢鐮孢菌，其次為茄病鐮孢菌，同色鐮孢菌和串珠鐮孢菌均為弱致病菌[4-5]。為給當?shù)罔坭讲『Φ挠行Х揽靥峁┛茖W依據(jù)，從甘肅省枸杞主產區(qū)采集枸杞根腐病病株，從中分離鑒定出致病菌單隔鐮孢菌，觀察其菌絲在不同培養(yǎng)基、碳源、氮源和溫度、光照等條件環(huán)境下的生長情況，以探求能有效抑制其菌絲生長的栽培條件，從而有效防治枸杞根腐病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株樣品來源：供試的單隔鐮孢菌（F.dimerum，代號為M4）由“甘肅省內主要產區(qū)枸杞根腐病病原菌分離與鑒定”SRTP項目小組提供。

試驗用的藥品：胰蛋白胨、磷酸氫二鉀、葡萄糖、瓊脂、結晶硫酸亞鐵、結晶硫酸鎂、氯化鉀、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘油、硝酸鉀、硝酸鈉、甘氨酸、硫酸銨。

試驗用的儀器設備：SW-CJ-2FD型潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KB8型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；DHG-9440A型電熱恒溫鼓風干燥箱，寧波江南儀器廠；BS224S型分析電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；金怡HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）[6]、馬鈴薯蔗 糖瓊 脂 培 養(yǎng) 基 （Potato Sucrose Agar，PSA）[5]、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（Malt-extract Agar Medium，MEA）[7-8]、豆芽汁瓊脂培養(yǎng)基（Bean-sprouts Agar Medium，BSA）[9]、胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖培養(yǎng)基（Tryptone Yeast Extract Glucose，TYEG）[10]和基本培養(yǎng)基（Minimal Medium，MM）[5,8,11]。

供試碳源有葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘油；供試氮源包括硝酸鉀、硝酸鈉、甘氨酸、硫酸銨。

1.3 方 法

1.3.1 單隔鐮孢菌最適培養(yǎng)基的篩選

用內徑為5mm的滅菌打孔器從在PDA培養(yǎng)基上28 ℃下活化培養(yǎng)的M4菌株的菌落中切取邊緣菌餅，將菌餅分別轉接到PDA、PSA、BSA、MEA、TYEG培養(yǎng)基中，在25 ℃的恒溫條件下連續(xù)光照培養(yǎng)7 d，每處理設3次重復。

采用“十”字交叉法分別于培養(yǎng)第3、5、7天記錄各處理的菌落直徑，以所測數(shù)值減去5mm后即可得到該菌株的凈生長量。

1.3.2 光照對菌株生長的影響

按照1.3.1的方法將M4菌株轉接至PDA培養(yǎng)基中央后，分別置于全光照、全暗和12 h光暗交替的培養(yǎng)環(huán)境下，于25 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)7 d，每處理設3次重復。

采用“十”字交叉法于培養(yǎng)第7天記錄各處理的菌落直徑，以所測數(shù)值減去5mm后即可得到該菌株的凈生長量。

1.3.3 溫度對菌株生長的影響

按照1.3.1的方法將M4菌株轉接至PDA培養(yǎng)基中央后，分別置于5、15、25、35、45 ℃的恒溫條件下連續(xù)黑暗培養(yǎng)7 d，每處理設3次重復。

采用“十”字交叉法于培養(yǎng)第7天記錄各處理的菌落直徑，以所測數(shù)值減去5mm后即可得到得到該菌株的凈生長量。

1.3.4 pH值對菌株生長的影響

用1 mol·L－1的NaOH標準液和1 mol·L－1的HCl標準液將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調至3、4、5、6、7、8、9、10，再按照1.3.1的方法將M4菌株分別轉接到已調好pH值的PDA培養(yǎng)基中，置于25 ℃的恒溫條件下連續(xù)光照培養(yǎng)7 d，每處理設3次重復。

采用“十”字交叉法于培養(yǎng)第7天分別記錄各處理的菌落直徑，以所測數(shù)值減去5mm后即可得到該菌株的凈生長量。

1.3.5 單隔鐮孢菌對碳源的利用

在1 000 mL的基本培養(yǎng)基中加入硝酸鉀（0.277 g·L－1），以之為氮源，并將之分裝至錐形瓶中，用121 ℃的LDZX-30KB8型立式壓力蒸汽滅菌器高壓蒸汽滅菌30 min，將供試的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘油這4種氮源均按20 g·L－1的濃度進行配置，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時再加入滅菌的不同碳源，以無碳源培養(yǎng)基處理作為對照（CK1），按照1.3.1的方法將M4菌株分別轉接到含有不同碳源的培養(yǎng)基中，置于25℃的恒溫條件下連續(xù)光照培養(yǎng)7 d，每處理設3次重復。

采用“十”字交叉法分別于培養(yǎng)第3、5、7天記錄各處理的菌落直徑，測量數(shù)字減去5mm后得到該菌株的凈生長量。

1.3.6 單隔鐮孢菌對氮源的利用

在1 000 mL的基本培養(yǎng)基中加入葡萄糖（20 g·L－1），以之為碳源，并將之分裝至錐形瓶中，用121 ℃的LDZX-30KB8型立式壓力蒸汽滅菌器高壓蒸汽滅菌30 min，將供試的硝酸鉀、硝酸鈉、甘氨酸、硫酸銨這4種氮源均按0.277 g·L－1的濃度進行配置，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時，加入滅菌的不同氮源，設置無氮源培養(yǎng)基為對照（CK2），按1.3.1的方法將M4菌株分別轉接到含有不同氮源的培養(yǎng)基中，置于25 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)7 d，每處理設3次重復。

采用“十”字交叉法分別于培養(yǎng)第3、5、7天記錄各處理的菌落直徑，測量數(shù)字減去5mm后得到該菌株的凈生長量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Mirsoft of fi ce 2007和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，利用單因素方差分析法（oneway ANOVA）進行方差分析，顯著性檢驗采用DPS軟件的Duncan法，所有數(shù)值均為平均值±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基對菌落生長的影響

不同培養(yǎng)基對菌株生長的影響情況見表1。單隔鐮孢菌在幾種供試的培養(yǎng)基中均可生長，但其生長狀況及生長速率卻有所不同。菌株在豆芽汁培養(yǎng)基上生長最快且其菌絲生長最好，其次是PDA培養(yǎng)基，其余3種培養(yǎng)基上的菌絲生長狀況大致相同。因此，豆芽汁培養(yǎng)基為單隔鐮孢菌生長的最佳培養(yǎng)基。

表1 M4菌株在不同培養(yǎng)基上的生長狀況與生長量?Table 1 Growth status and increments of the M4 strain in different media

2.2 光照條件對菌落生長的影響

不同光照條件下M4菌株生長量的多重比較結果見表2。由表2可知，不同光照條件下M4菌株其菌絲生長量間差異極顯著。連續(xù)光照和12 h光暗交替的光照條件對菌絲生長的影響均較小，這兩種處理的菌絲生長量間無顯著性差異，但其菌落形態(tài)有所不同；而連續(xù)黑暗對菌絲生長的影響卻較大。

表2 不同光照條件下M4菌株生長量的多重比較結果Table 2 Multiple comparison of increments of the M4 strain under different light conditions

2.3 培養(yǎng)溫度對菌落生長的影響

不同培養(yǎng)溫度對菌落生長的影響情況如表3所示。表3表明，不同溫度條件對菌絲生長量的影響有顯著性差異。M4菌株在15～35 ℃的溫度范圍內其菌絲均可生長，且在35 ℃時的生長量最大。當培養(yǎng)溫度分別為5和45 ℃時，其菌絲生長受到嚴重抑制，且測不出其生長量。當培養(yǎng)溫度為15 ℃時，其菌落呈圓形，氣生菌絲呈白色，背面中心呈棕綠色，邊緣呈黃色；當培養(yǎng)溫度為25 ℃時，其菌落呈圓形，氣生菌絲呈白色，背面中央呈灰綠色，邊緣呈米黃色；當培養(yǎng)溫度為35 ℃時，其菌落呈白色，背面呈黃色。

2.4 培養(yǎng)基的pH值對菌落生長的影響

培養(yǎng)基的pH值對菌落生長的影響情況亦如表3所示。由表3可知，單隔鐮孢菌在pH值為4～10的PDA培養(yǎng)基中均可生長。當PDA培養(yǎng)基的pH值分別為5、6、7、8、10時，其對菌絲生長的影響均不顯著，pH值分別為4與9的PDA培養(yǎng)基對菌絲生長的影響顯著；當PDA培養(yǎng)基的pH值為9時，菌絲生長量最大，培養(yǎng)第7天的菌絲生長量為6.07cm；當PDA培養(yǎng)基的pH值為4時，菌絲生長量最小，培養(yǎng)第7天的菌絲生長量為4.52cm。當其pH值為4時，菌落中央呈玫紅色，背面呈磚紅色；當其pH值分別為5、6、7、8、9時，菌落中央呈灰棕色，且隨著pH值的升高其顏色變淺，范圍變小，背面呈黃色；隨著pH值的降低，菌落中央出現(xiàn)綠色和紅色。

表3 不同溫度與pH值影響下M4菌株的菌絲生長量Table 3 Mycelium increments of the M4 strain under different temperatures and pH values

2.5 單隔鐮孢菌對碳源的利用

不同碳源與氮源條件下M4菌株的菌絲生長量見表4。由表4 可知，單隔鐮孢菌能夠利用供試的4種碳源，這4種碳源對其生長量的影響，除以葡萄糖、甘油和麥芽糖為碳源的各處理與對照間的差異均不顯著外，其余各種碳源處理間均有顯著差異，其中，以乳糖為碳源的生長最佳，葡萄糖的次之。

2.6 單隔鐮孢菌對氮源的利用

不同氮源條件下M4菌株的菌絲生長量亦見表4。由表4 可知，單隔鐮孢菌能夠利用供試的4種氮源，其中甘氨酸、硝酸鉀、硝酸鈉對菌絲生長的影響差異均不顯著。以甘氨酸、硝酸鉀、硝酸鈉為氮源時，菌落生長形態(tài)正常；以硫酸銨為氮源時，菌落生長緩慢，且培養(yǎng)5天后其生長停滯；無碳源處理（對照）的菌落形態(tài)尚未形成，其菌絲極其稀疏，且不易觀察到。

表4 不同碳源與氮源條件下M4菌株的菌絲生長量Table 4 Mycelium increments of the M4 strain under different carbon sources and nitrogen sources

3 結論與討論

試驗中發(fā)現(xiàn)，單隔鐮孢菌在PDA、PSA、BSA、MSA、TYEG培養(yǎng)基上均能生長，其中BSA培養(yǎng)基更適合單隔鐮孢菌的生長，而其在PSA培養(yǎng)基上的生長速度最慢。單隔鐮孢菌能利用供試碳源乳糖、葡萄糖、甘油、麥芽糖和供試氮源甘氨酸、硝酸鉀、硝酸鈉、硫酸銨，但不同碳源和氮源對單隔鐮孢菌菌落生長的影響均較大。單隔鐮孢菌能夠利用甘氨酸、硝酸鉀、硝酸鈉這3種氮源進行生長，且能很好地利用乳糖碳源進行生長，其菌落生長較快，形態(tài)正常；其對硫酸銨的利用效果差，菌落生長較慢，其形態(tài)不規(guī)則，且培養(yǎng)第5天后其生長停滯。在無碳源條件下，菌落能夠正常生長，而在無氮源條件下，只有極其稀疏的菌絲生長，菌落形態(tài)不明顯，表明單隔鐮刀菌的營養(yǎng)生長主要依賴于氮源。

研究中還發(fā)現(xiàn)，單隔鐮孢菌菌絲在連續(xù)光照、連續(xù)黑暗和12 h光暗交替的環(huán)境下均能生長，而連續(xù)黑暗能抑制菌絲生長。單隔鐮孢菌在溫度為15～35 ℃的范圍內均可生長，且菌落茂密；但在5、45 ℃的溫度條件下其生長停滯，其生長適溫為15～35 ℃，說明該菌株適宜相對中溫偏高的環(huán)境。單隔鐮孢菌菌株能在pH值為4～10的培養(yǎng)基上生長，最適于單隔鐮孢菌生長的pH值為9，說明該菌株適于偏堿性條件下生長。

可見，單隔鐮孢菌對環(huán)境的適應能力強，這一特性使得它們能夠在枸杞種植區(qū)內生存。甘肅枸杞主要產區(qū)的氣候和環(huán)境正好為它們提供了良好的生存條件，況且枸杞又是多年生的植物，土壤帶菌量會逐年積累，這是造成枸杞根腐病逐年加重的原因之一。

枸杞根腐病防治的主要目標是抑制單隔鐮孢菌的生長。在生產實際中主要以健康栽培和生物防治、物理防治、農業(yè)防治為主，以化學防治為輔，還可通過改變栽培技術來減輕此病危害的程度，最大限度地減少農藥的使用量，盡可能實現(xiàn)無公害化栽培。同時，通過合理施肥，既可提高枸杞林木生長量和產品產量，還能提高產品的品質[12-14]。另外，通過控制單隔鐮孢菌生長發(fā)育的適宜條件來抑制根腐病病原菌的生長，進而減輕枸杞病害的危害程度。

試驗結果表明，單隔鐮孢菌在連續(xù)黑暗、強堿性、超低溫或高溫環(huán)境下其生長受到抑制。因此，枸杞應栽植于強堿性土壤，在開花結果時可采用遮陽網遮陰、灌水等防治措施，以營造暗環(huán)境，降低土溫，抑制病原菌的滋生。同時，對于發(fā)病區(qū)，可采用輪作方式，栽植時要平整土地，起壟栽培，以降低地下水位，減少根際積水，防止堿性離子堆積于枸杞根部；除草、翻耕土地時應盡可能避免傷根；采用配方施肥技術，增施磷肥、鉀肥，避免施用未經腐熟的農家肥。近年來，隨著分子生物學的快速發(fā)展，本試驗運用傳統(tǒng)的試驗方法進行研究，可能存在很多方面的不足，因此，今后對此病原菌的致病機理等方面的問題，應采用分子生物學的方法作進一步的試驗研究。

[1]張 莉,李茂哉,楊 斌.甘肅省枸杞產業(yè)化發(fā)展中存在的突出問題及發(fā)展建議[J].甘肅林業(yè)科技,2010,35(1)：57－60.

[2]薛福祥.枸杞主要病蟲害的識別與防治[J].甘肅科技縱橫,2009, 38(3)：52 － 53.

[3]申培增,關參政.幾種殺螨劑對枸杞癭螨的防治效果比較[J].經濟林研究,2013,31(3)：140－142.

[4]劉振榮.枸杞枯萎病研究初報[J].林業(yè)科技通訊, 1981, (5)：43－45.

[5]劉淑娟.景泰縣草窩灘鎮(zhèn)枸杞根腐病的發(fā)生及防治[J].防護林科技 ,2009,(3)：116－ 117.

[6]錢存柔.微生物學實驗[M].第1版.北京：北京大學出版社,1999：42.

[7]柴兆祥,李金花,辛劍鋒.磚紅鐮孢生物學特性研究[J].植物病理學報,2004,34(5)：409－413.

[8]鄭肖蘭,崔昌華,馮慧麗,等.尖孢鐮刀菌西瓜?；途甑纳飳W特性[J].熱帶作物學報,2006,27(1)：97－100.

[9]劉麗云,劉曉林,劉志恒,等.辣椒根腐病菌生物學特性研究[J].沈陽農業(yè)大學學報,2007,38(1)：54－58.

[10]秦涵淳,楊臘英,李松偉,等.培養(yǎng)基營養(yǎng)成分對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌生長的影響[J].熱帶作物學報, 2009, 30(12)：1853－1857.

[11]李智敏,陳建斌,周惠萍,等.花椒根腐病病原鑒定和生物學特性研究[J].云南農業(yè)大學學報,2006,21(5)：591－595.

[12]潘曉杰,侯紅波,廖 芳,等.配方施肥對油茶中幼林營養(yǎng)生長的影響[J].中南林學院學報,2003,23(2)：82－84.

[13]王會勤,杜紅巖,杜蘭英,等.施肥對果園化栽培條件下杜仲生長和結果的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報,2010,30(6)：38－42.

[14]韓宏偉,王建友,李 勇,等.沙壤土條件下不同施肥水平對成齡枸杞生長及產量的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報,2015, 35(4)： 46 － 50.

Biological characteristics of root rot pathogen inLycium barbarum

ZHU Xiao-feng1, LIU Hong-jun1, XI Jun-qiang2, MENG Wen-sheng1, PEI Yan-hong1
(1. Management Station of Forest Tree Seedlings of Zhangye City, Zhangye 734000, Gansu, China;2. Guanshan Forestry Authority of Pingling City, Pingliang 744100, Gansu, China )

In order to provide a scienti fi c basis for control of root rot pathogen inLycium barbarum, growth state and characteristics ofFusarium dimerumwere observed and analyzed under the conditions of different medium, temperature,pH value, carbon source and nitrogen source, which was isolated from rotted root inL. barbarumat main production areas of Gansu. The results showed that： the best medium forF. dimerumgrowth was the bean-sprouts-extract medium;the most suitable temperature range was 15-35 ℃ , and the optimum growth temperature was 35 ℃ ; suitable pH value range was from 4 to 10, and the optimal pH value was 9; four carbon sources could be used, and utilization effect of lactose was the best; four nitrogen sources could be used, and utilization effect of ammonium sulfate was the best;alternation of light and darkness was conducive to mycelium growth, and continuous dark culture condition could inhibit mycelium growth.

Lycium bararum; root rot; pathogenic bacteria; biological characteristics

S664.9；S763.15

A

1003—8981(2015)04—0128—05

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.04.024

2014-10-19

甘肅省林果產業(yè)科技創(chuàng)新項目（2012）。

朱曉峰，助理工程師。

劉宏軍，林業(yè)工程師。E-mail：zylmzm@126.com

朱曉峰,劉宏軍,席軍強,等.枸杞根腐病病原菌的生物學特性研究[J].經濟林研究,2015,33(4)：128－132.

[本文編校：伍敏濤]