鐘展華,鄒曉東,萬(wàn)小春,丁 渭,嚴(yán)鳳好
(1、惠州市中心血站,廣東惠州516000;2、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司,廣東廣州510665)
一種低成本血液HIV病毒核酸篩查系統(tǒng)的開發(fā)和應(yīng)用
鐘展華1,鄒曉東1,萬(wàn)小春1,丁 渭2,嚴(yán)鳳好1
(1、惠州市中心血站,廣東惠州516000;2、中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司,廣東廣州510665)
目的開發(fā)一種低成本,有效和方便快捷的血源篩查核酸檢測(cè)系統(tǒng)。方法利用臨床上使用的HIV-1核酸定量檢測(cè)試劑,用酶免實(shí)驗(yàn)用的加樣器對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行混樣和核酸提取。結(jié)果使用常規(guī)方法和加樣器改進(jìn)方法的檢測(cè)有效性沒(méi)有差異,經(jīng)過(guò)加樣器改進(jìn)的方法檢測(cè)速度快,比常規(guī)手工方法勞動(dòng)強(qiáng)度大大降低。結(jié)論低成本血液HIV病毒核酸篩查系統(tǒng),成本低,效率高,可以有效提高血液的安全性。
低成本核酸檢測(cè);血液安全;PCR;HIV
核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)直接檢測(cè)病毒核酸,因其可縮短病毒檢測(cè)的窗口期而被應(yīng)用于獻(xiàn)血者篩查。西方發(fā)達(dá)國(guó)家1999年開始已經(jīng)將NAT檢測(cè)納入獻(xiàn)血者的常規(guī)篩查項(xiàng)目,輸血感染傳染病的危險(xiǎn)性因而大大降低。我國(guó)近兩年大力推進(jìn)核酸檢測(cè),但核酸檢測(cè)的成本很高,很多中小血站無(wú)法承受昂貴的檢測(cè)費(fèi)用。筆者所在血站與達(dá)安基因公司合作,將應(yīng)用于臨床的HIV PCR核酸定量試劑用于血液篩查,并利用現(xiàn)有的加樣器對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行改進(jìn),提高了檢測(cè)效率,降低了檢測(cè)成本。現(xiàn)將有關(guān)內(nèi)容報(bào)告如下。
1.1 檢測(cè)標(biāo)本2013年12月至2015年7月我站無(wú)償獻(xiàn)血的留樣常規(guī)標(biāo)本,使用5ml帶分離膠EDTAK2真空采血管留樣,1500r/min離心5min后2~8℃冰箱保存。
1.2 儀器7500熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司);瑞士哈米爾頓STAR自動(dòng)加樣儀及其配套一次性加樣針(瑞士HAMILTON公司);單通道連續(xù)移液器(法國(guó)Gilson公司);恒溫金屬?。ńK金壇)。
1.3 試劑和耗材HIV核酸定量試劑盒(PCR-熒光探針?lè)ǎ◤V州達(dá)安基因)、核酸提取試劑盒(離心柱法)、HIV-1 RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(北京康徹斯坦生物,濃度為2000IU/ml,批號(hào):201312001)、無(wú)水乙醇、經(jīng)高壓滅菌的一次性離心管和吸頭、滅菌1.6ml深孔板等采購(gòu)市售產(chǎn)品。
1.4 標(biāo)準(zhǔn)的核酸提取方法吸取每人份20μl血漿進(jìn)行11人份混樣,將混樣的標(biāo)本分配到已加入50μl蛋白酶K的1.5ml離心管內(nèi),按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行核酸提?。杭硬《玖呀庖骸鹗帯x心→溫育→加無(wú)水乙醇→震蕩→離心→轉(zhuǎn)移到離心柱→離心→加入抑制物去除劑→離心→換收集管→加入去離子液→離心→換收集管→加入去離子液→離心→換收集管→離心→換離心管→烘干→加洗脫液→靜置→離心→分配反應(yīng)液→加樣→蓋八連管蓋子→離心→上機(jī)。
1.5 改進(jìn)的核酸提取方法
1.5.1 標(biāo)本匯集和留樣使用全自動(dòng)加樣器進(jìn)行標(biāo)本匯集,每人份吸取20μl血漿進(jìn)行11人份混樣,加入1.6ml深孔板里,混樣前先在一個(gè)1.6ml深孔板每個(gè)標(biāo)本留樣400μl,用于一旦檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性后進(jìn)行單個(gè)樣品拆分檢測(cè)。
1.5.2 病毒裂解使用全自動(dòng)加樣器每個(gè)孔分配50μl預(yù)先配置好的蛋白酶K和Carry RNA混合液后吹打8次進(jìn)行混勻,加入200μl病毒裂解液,將深孔板蓋上封板膜后,放入72℃水浴箱溫浴10min。
1.5.3 過(guò)柱和洗柱將離心柱從收集管取出,套到普通10ml的纖維試管上,將已經(jīng)加入無(wú)水乙醇的反應(yīng)混合液分配到離心柱上。用普通的臺(tái)式離心機(jī)將套有離心柱的纖維試管進(jìn)行3000r/min 2min離心。分別進(jìn)行過(guò)柱和洗柱,洗柱時(shí),利用10ml連續(xù)加樣槍分配抑制物去除液和去離子液。第二次將去離心水離心后,將離心柱裝至新的收集管,將收集管-離心柱于室溫下14000r/min離心3min以去除殘余的乙醇。剩下的步驟按照試劑說(shuō)明書操作,最后取得病毒核酸溶液。
1.5.4 加樣利用STAR加樣器和300μl帶濾芯的加樣尖,將反應(yīng)液和待測(cè)核酸分配至8連管,8連管利用1.6ml深孔板進(jìn)行位置固定。
1.6 檢測(cè)的靈敏度及重復(fù)性測(cè)試以陰性血漿稀釋HIV-1 RNA(2000IU/ml)標(biāo)準(zhǔn)品,配制成核酸拷貝數(shù)分別為1000、500、250、100、50、25IU/ml的HIV應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品溶液。于不同時(shí)間配制不同拷貝數(shù)的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品溶液,進(jìn)行重復(fù)核酸擴(kuò)增檢測(cè),以觀察擴(kuò)增體系的穩(wěn)定性,每個(gè)梯度共檢測(cè)20份。
1.7 檢測(cè)質(zhì)量保證方法將內(nèi)標(biāo)溶液用洗脫液(DEPC水)稀釋20倍,如內(nèi)標(biāo)結(jié)果是陰性,進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。如HIV結(jié)果為陽(yáng)性,將原混合標(biāo)本和單個(gè)標(biāo)本均進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。
2.1 不同檢測(cè)體系的靈敏度及重復(fù)性比較標(biāo)準(zhǔn)的提取方法和改進(jìn)后的提取方法以對(duì)不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)情況見表1和表2,兩者對(duì)≥100IU/ ml拷貝數(shù)HIV標(biāo)準(zhǔn)品的檢出率均為95%,無(wú)顯著差異。
2.2 獻(xiàn)血標(biāo)本檢測(cè)情況獻(xiàn)血者標(biāo)本108194份,11人份混合后共檢測(cè)出混合陽(yáng)性49例,經(jīng)過(guò)混合標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)及拆分檢測(cè),最終CDC確認(rèn)陽(yáng)性48例。其中有一例第一次確認(rèn)結(jié)果為不確定,10d后再次抽取的血樣確認(rèn)為陽(yáng)性。
2.3 檢測(cè)系統(tǒng)的有效性驗(yàn)證結(jié)果在檢測(cè)過(guò)程中,不定時(shí)將濃度為2000IU/ml的的HIV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為盲樣隨機(jī)插入已檢測(cè)的陰性標(biāo)本中,總共測(cè)試42例,均能成功檢出。
表1 標(biāo)準(zhǔn)核酸提取方法的HIVRNA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性
表2 改進(jìn)核酸提取方法的HIVRNA標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)靈敏度和重復(fù)性
國(guó)外有研究顯示,處于HIV酶免窗口期的窗口期的血液具有高濃度病毒血癥,HIV傳播效率最高,56%~92%新的HIV感染是由處在這個(gè)時(shí)期的HIV感染者傳播的[1]。近期發(fā)生在四川的因輸血而感染HIV的事件證實(shí)了這一點(diǎn),事后經(jīng)過(guò)當(dāng)?shù)谻DC的調(diào)查,確認(rèn)為酶免窗口期感染,經(jīng)過(guò)對(duì)留樣的標(biāo)本重新檢測(cè),第三代和第四代的酶免HIV診斷試劑依然均為陰性,但核酸檢測(cè)顯示是其病毒濃度高達(dá)37000IU/ml[2]。從前期已經(jīng)開展核酸檢測(cè)的血站,不斷有報(bào)道檢測(cè)出HIV窗口期的標(biāo)本,如常州[3]、武漢[4]、遼寧[5]和濟(jì)南[6]等,雖然2012版的《血站技術(shù)操作規(guī)程》和《全血和成分血質(zhì)量要求》沒(méi)有規(guī)定必須強(qiáng)制核酸檢測(cè),但國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)已將核酸檢測(cè)作為血站2015年前必須完成的目標(biāo)進(jìn)行了規(guī)定[7]。因?yàn)槲覈?guó)的HIV感染率有上升的趨勢(shì),血液安全的形式不容樂(lè)觀[8-15]。
但目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上獲得我國(guó)食品和藥品監(jiān)督部門使用許可的核酸血液篩檢試劑均含全套設(shè)備包括混樣、核酸提取和熒光定量PCR儀均是進(jìn)口的,成本較高。對(duì)于中小血站,如果沒(méi)有獲得政府財(cái)政的額外撥款,檢測(cè)費(fèi)用是個(gè)巨大的負(fù)擔(dān)。國(guó)內(nèi)很多生物技術(shù)企業(yè),已經(jīng)利用熒光PCR方法開發(fā)出成熟的NAT定量檢測(cè)產(chǎn)品,主要用于傳染病的診斷、病毒載量測(cè)定及抗病毒治療效果評(píng)估,但這些產(chǎn)品只獲得食品和藥品監(jiān)督部門臨床診斷使用許可,而且操作繁瑣和復(fù)雜。血站與醫(yī)院的核酸檢測(cè)相比,具有不同的特點(diǎn),一是時(shí)間緊迫、當(dāng)碰到急救用血的時(shí)候,檢測(cè)結(jié)果不能拖延太長(zhǎng)時(shí)間。二是血站的樣本量一般都比較大。所以如果完全按照臨床的方法進(jìn)行檢測(cè),無(wú)論是時(shí)間還是成本均無(wú)法滿足血站的實(shí)際工作要求。
本研究我們采取了幾個(gè)措施來(lái)降低核酸檢測(cè)的成本,一是只檢測(cè)HIV、HBV和HCV暫時(shí)不檢測(cè),同時(shí),HIV檢測(cè)保留2遍ELISA方法。二是將標(biāo)本進(jìn)行混樣后再檢測(cè),為了跟酶免檢測(cè)銜接和拆分方便,混樣的數(shù)量我們確定為11個(gè),因?yàn)橐粋€(gè)酶標(biāo)檢測(cè)微板,有96孔,12豎排,在混樣前,先用1.6ml深孔板留樣,第一豎排作為一旦出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)的備查標(biāo)本,其他11橫排的留樣標(biāo)本作為出現(xiàn)陽(yáng)性后,進(jìn)行單個(gè)標(biāo)本拆分檢測(cè)。三是將標(biāo)本混樣的工作交由進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)的加樣器來(lái)完成。四是核酸提取的方法磁珠法改為離心柱法,將核酸提取由核酸提取儀改為手工提取,同時(shí),為了提高檢測(cè)效率,利用加樣器對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。經(jīng)過(guò)以上措施,可以將核酸檢測(cè)的成本降低為血篩試劑的10%左右,相當(dāng)于加做一遍HIV的酶免實(shí)驗(yàn)的費(fèi)用。
雖然用以上方法將核酸檢測(cè)的成本大大降低,但從以上數(shù)據(jù)表明,我們的檢測(cè)方法是有效和適合在血站應(yīng)用的。首先是內(nèi)對(duì)照的稀釋和成功檢出,有研究證明,濃度過(guò)高的內(nèi)對(duì)照,會(huì)影響弱陽(yáng)性的檢出[16],我們對(duì)內(nèi)對(duì)照的稀釋提高了檢測(cè)的靈敏度。其次是第二是使用濃度為2000IU/ml的的HIV RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為盲樣檢測(cè),均能成功檢出,檢出靈敏度符合美國(guó)FDA和歐洲對(duì)血篩核酸檢測(cè)的靈敏度要求,即混合檢測(cè)時(shí)單份獻(xiàn)血者血液的檢出靈敏度至少為5000IU/ml(95%檢出率)[17]。國(guó)外已有研究證明,50~100人份的血漿混合物不會(huì)減弱核酸檢測(cè)系統(tǒng)的敏感度。HIV急性感染的陽(yáng)性結(jié)果一般在10000IU/ml以上[18],所以考慮到即使RNA部分降解,11倍稀釋以后的標(biāo)本病毒濃度也在檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度內(nèi)。其次是我們和酶免檢測(cè)是同步進(jìn)行的,從2013年10月至2014年7月,共有21份確診HIV陽(yáng)性標(biāo)本,我們的檢測(cè)系統(tǒng)能夠全部檢出來(lái),跟HIV確診實(shí)驗(yàn)符合率100%,且無(wú)1例假陽(yáng)性。最后是利用現(xiàn)有加樣器對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn),既減輕工作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度,從混樣到上機(jī)檢測(cè),354例標(biāo)本共耗時(shí)約4h,手工操作的步驟,只剩下試劑的配置,離心柱的離心洗滌等,僅需時(shí)1.5h左右。又因?yàn)楦该鈾z測(cè)同步進(jìn)行,不影響血液的發(fā)放時(shí)間。
對(duì)于核酸檢測(cè),有2個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),一是要順利將核酸提取出來(lái),在血液標(biāo)本采集和提取過(guò)程中要盡量減少核酸的降解,防止假陰性。二要防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染環(huán)境而引起以后的假陽(yáng)性。為了開展核酸檢測(cè),我們參照臨床基因擴(kuò)增(PCR)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室規(guī)范的要求裝修了實(shí)驗(yàn)室,核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室分為三個(gè)區(qū),分別為試劑配制室、標(biāo)本處理室和擴(kuò)增檢測(cè)室,3個(gè)室之間用緩沖間隔離。因?yàn)闃?biāo)本混樣和核酸提取過(guò)程用到的加樣器是和酶免實(shí)驗(yàn)共用的,為了減少環(huán)境中的RNA酶對(duì)RNA的降解,我們每天做完酶免實(shí)驗(yàn)后,對(duì)酶免酶免實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行徹底消毒,第二天早上先做核酸的混樣和提取,核酸提取工作完成后,再做酶免實(shí)驗(yàn)。為了防止擴(kuò)增后產(chǎn)物對(duì)環(huán)境的污染,在擴(kuò)增反應(yīng)前,反復(fù)檢查擴(kuò)增反應(yīng)的8連管,確保蓋子蓋緊,反應(yīng)完畢后,用多層密封袋將8連管密封后再帶出擴(kuò)增反應(yīng)室,擴(kuò)增反應(yīng)室內(nèi)的大功率風(fēng)機(jī)24h開著,確保擴(kuò)增反應(yīng)室的負(fù)壓。
核酸檢測(cè)是有史以來(lái)成本最高的血液篩查項(xiàng)目,在我國(guó)這樣一個(gè)發(fā)展中國(guó)家,地區(qū)發(fā)展差異大,全國(guó)有不少中小血站,如果未取得當(dāng)?shù)刎?cái)政的額外撥款,是沒(méi)有足夠的經(jīng)費(fèi)來(lái)開展全自動(dòng)的核酸檢測(cè)系統(tǒng)的。而像我們這種半自動(dòng)的核酸檢測(cè)系統(tǒng),充分利用了實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的條件,費(fèi)用低廉,雖然靈敏度和操作方便性跟全自動(dòng)的商品化的核酸檢測(cè)系統(tǒng)還有差距,但其檢測(cè)的靈敏度已經(jīng)高于歐盟和FDA對(duì)血液篩查HIV靈敏度的要求。實(shí)際上,根據(jù)國(guó)際輸血協(xié)會(huì)輸血傳播傳染性疾病工作組的調(diào)查,即使在發(fā)達(dá)國(guó)家的血液中心(如德國(guó)和奧地利等)除了有商品化的核酸檢測(cè)系統(tǒng),也有自建的核酸檢測(cè)系統(tǒng)[19]。如何繼續(xù)提高檢測(cè)的靈敏度,將是我們未來(lái)研究的方向。
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Development and application of a low-cost nucleic acid screening system for the detection of blood transmitted HIV
ZHONG Zhanhua,ZOU Xiaodong,WAN Xiaochun,et al.Huizhou Blood Center,Huizhou Guangdong 516000,China.
Objective To develop a low-cost nucleic acid detection system for efficient and rapid detection of blood transmitted HIV.Methods The pipettes of ELISA experiments were used to mix blood samples and do with the nucleic acid.Accordingly,the nucleic acid was tested using HIV-1 nucleic acid quantitative detection reagents.Results There was no difference in the effectiveness of conventional methods and pipette improved methods,while the latter showed the more efficient and quicker features.Conclusion The Low-costnucleic acid screening system was able to detect blood transmitted HIV economically and efficiently,which could effectively improve the security use of blood.
Low-cost nucleic acid testing;Blood safety;PCR;HIV
R512.91
A
1674-1129(2015)06-0724-03
10.3969/j.issn.1674-1129.2015.06.010
2015-09-17;
2015-11-01)
鐘展華,男,1976年8月生,碩士,副主任技師,專業(yè):醫(yī)學(xué)檢驗(yàn),研究方向:血液安全與采供血信息化建設(shè)。