王 強(qiáng) 王 存 王 睿 任彥榮
(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)
微波輔助水酶法提取番茄籽油工藝優(yōu)化及理化特性研究
王 強(qiáng) 王 存 王 睿 任彥榮
(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系,重慶 400067)
以番茄籽為原料提取番茄籽油,通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助復(fù)合酶法提取番茄籽油(MEOs)工藝,并建立回歸模型;同時(shí)研究了MEOs的理化特性、脂肪酸組成和抗氧化活性,并與傳統(tǒng)索氏提取番茄籽油(SEOs)進(jìn)行比較。結(jié)果表明,采用復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶∶蛋白酶=1∶1∶1)的最佳提取工藝為酶添加量1.5%、溫度35℃、時(shí)間40 min、微波功率500 W,在此條件下MEOs得率為29.65%;MEOs與SEOs在理化特性方面沒(méi)有顯著區(qū)別,但MEOs含有較高的生育酚,同時(shí)具有較高的氧化穩(wěn)定性。MEOs表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性,在DPPH·和β-胡蘿卜素-亞油酸測(cè)試體系中其IC50分別為9.52和10.64 mg/mL。MEOs是一種理想的天然保健食品原料,具有較好的開(kāi)發(fā)利用前景。
番茄籽油 微波輔助水酶法提取 理化特性 抗氧化活性
番茄是一種重要的蔬菜作物,番茄產(chǎn)品深加工過(guò)程中產(chǎn)生了大量廢棄物,其中約60%是番茄籽[1]。因此,如何高效利用這些番茄籽成為副產(chǎn)物深加工業(yè)亟待解決的問(wèn)題[2]。目前國(guó)內(nèi)外由于缺乏相應(yīng)的番茄籽深加工技術(shù),番茄籽基本上用作飼料和肥料,資源利用率低[1-2]。番茄籽中含有豐富的油脂,同時(shí)番茄籽油還富含生育酚和植物甾醇等生物活性成分,是一種優(yōu)質(zhì)的食用植物油資源。
微波輔助水酶法通過(guò)機(jī)械和酶解雙重手段降解植物細(xì)胞壁,使油脂釋放出來(lái)。采用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等生物酶制劑破壞油料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),可有效提高油料油脂的提取率[3-4]。在水酶法應(yīng)用基礎(chǔ)上,微波處理可以減少溶劑提取時(shí)的傳質(zhì)阻力,使其內(nèi)部壓力超過(guò)細(xì)胞壁膨脹承受限值,導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂,細(xì)胞內(nèi)有效成分流出,在較低的溫度條件下即可溶于介質(zhì)中,參與化學(xué)反應(yīng)。與傳統(tǒng)單一提取技術(shù)相比,微波輔助水酶法提取植物油脂具有諸多優(yōu)點(diǎn):油脂得率和品質(zhì)高,工藝條件和技術(shù)設(shè)備簡(jiǎn)單,能耗低;資源的綜合利用率高,有利于油脂工業(yè)的綠色發(fā)展[5-7]。采用微波輔助水酶法提取番茄籽油,目前鮮有報(bào)道。本研究對(duì)番茄籽油的微波輔助水酶法提取工藝及其理化特性進(jìn)行了研究,以期為番茄籽資源的開(kāi)發(fā)利用和番茄籽油的生產(chǎn)加工提供參考。
番茄籽:新疆鴻翔番茄制品有限責(zé)任公司;DPPH·:美國(guó)Sigma-Aldrich公司;纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶:諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司。
MAS-II常壓微波合成/萃取反應(yīng)工作站:上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;FA2004A型分析天平:上海精天科貿(mào)有限公司。
將番茄籽樣品冷凍過(guò)夜置于冷凍干燥機(jī)(-50℃,100 Pa)中干燥。各樣品均干燥至含水量約為8%。干燥樣品進(jìn)行粉碎,將番茄籽粉(>100目)真空密封后置于常溫干燥器中以待分析。
1.2.2.1 微波輔助水酶法提取番茄籽油(MEOs)
參照J(rèn)iao等[8]的微波輔助水酶法提取工藝,番茄籽粉末(20 g)→滅酶→冷卻→設(shè)定微波輔助水酶法處理?xiàng)l件(料液比10∶1;pH 5;儀器攪拌速率5 000 r/min)→離心分離→清油。MEOs的精煉方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。MEOs得率=提取的番茄籽油/番茄籽原料干重×100%。
1.2.2.2 索氏提取番茄籽油(SEOs)
取干燥粉碎后的番茄籽,以正己烷(≥98.5%)作溶劑,用索氏提取器提取5 h,在干燥箱(溫度為(75±2)℃)中揮干殘留溶劑,得SEOs。SEOs的精煉方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。
根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果,在料液比10∶1、pH 5和儀器攪拌速率5 000 r/min的條件下研究酶的種類(lèi)及添加量(%,m/m)、溫度(℃)、時(shí)間(min)和微波功率(W)對(duì)MEOs得率的影響。單因素固定條件為:酶的種類(lèi)為纖維素酶∶果膠酶∶蛋白酶 =1∶1∶1,復(fù)合酶添加量1%、溫度45℃、時(shí)間70 min和微波功率350 W;選取復(fù)合酶添加量、溫度、時(shí)間和微波功率為自變量,MEOs得率為響應(yīng)值(Y),根據(jù)Box-Behnken design(BBD)原理,進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。
比重參考GB/T 5526—1985;折光指數(shù)參考GB/T 5527—2010;皂化值參考 GB/T 5534—2008;過(guò)氧化值(PV)和酸價(jià)按GB/T 5009.37—2003規(guī)定的方法測(cè)定;碘值按GB/T 5532—2008規(guī)定的方法測(cè)定;β-茴香胺值(p-AV)參照 GB/T 24304—2009測(cè)定。共軛二烯烴(CD,λ232nm)采用IUPAC method II的紫外光譜測(cè)定方法[10]??偵樱═T)含量采用Wong等[11]報(bào)道的比色法測(cè)定,TT含量以“mgα-生育酚/kg番茄籽油”表示。
1.2.5.1 樣品甲酯化 準(zhǔn)確量取3 mL番茄籽油,加入5 mL氫氧化鉀甲醇溶液(0.5 mol/L),水浴處理(70℃,10 min)至油珠完全消失,冷卻后加3 mL三氟化硼甲醇溶液(14%),70℃水浴5min,冷卻,加正己烷2 mL和飽和氯化鈉溶液2 mL,離心分層,上清液供GC-MS分析用。
1.2.5.2 色譜條件 DB-1毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm),載氣為 N2,流速14.4 mL/min,進(jìn)樣量:1μL,分流比為 60∶1;升溫程序:初始溫度 150℃,保持10 min,以0.75℃/min的速率升溫到205℃,再以2℃/min速率升溫至240℃,保持10 min。質(zhì)譜條件:采用GC-MS全掃描模式,質(zhì)量掃描范圍為m/z33~450;電離方式:電子轟擊;電子能量:70 eV;離子源溫度:230℃。積分方法采用面積歸一法。
參照 Kalantzakis等[12]測(cè)定方法,將濃度為10-4mol/L DPPH·乙酸乙酯溶液4 mL與不同濃度(0~30 mg/mL)的番茄籽油乙酸乙酯溶液(10%)1 mL混勻后于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度Ai;將 DPPH·4 mL與體積分?jǐn)?shù)為10%的乙酸乙酯1 mL混勻后測(cè)定吸光度Ac,將不同濃度的樣品溶液1 mL與乙酸乙酯4mL混勻后測(cè)定吸光度Aj,按式(1)計(jì)算DPPH·清除率,并求相應(yīng)的IC50值。
250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入1.0 mL 0.2 mg/mL的β-胡蘿卜素氯仿溶液,再依次加入25μL亞油酸和200 mg吐溫 -40,混合均勻后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)氯仿,然后加入100 mL氧飽和蒸餾水,劇烈振蕩即得反應(yīng)液。取上述反應(yīng)液2 400μL加入反應(yīng)管中,加入不同濃度梯度的待測(cè)樣品溶液100μL。在470 nm處測(cè)定起始吸光度,50℃溫育2 h后再測(cè)定吸光度。以不加樣品溶液的β-胡蘿卜素-亞油酸體系作為空白對(duì)照[13]。對(duì)過(guò)氧化抑制率按式(2)計(jì)算。并求相應(yīng)的IC50值。
式中:Acontrol-0、Acontrol-120為空白樣品起始和溫育2 h后的吸光度;Asample-0、Asample-120為待測(cè)樣品起始和溫育2 h后的吸光度。
通過(guò)Design-Expert 7.1.6軟件(STAT-EASE Inc.,Minneapolis,USA)對(duì)響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,建立多元回歸方程。采用SPSS 17數(shù)據(jù)處理軟件,各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±SD(n=3)表示,并進(jìn)行方差分析,LSD法進(jìn)行多重比較,P<0.05表示差異具有顯著性。
在水酶法提取食用油脂的工藝中,生物酶的選擇是影響油脂產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素[14]。如圖1a所示,與對(duì)照組(16.36%,不添加生物酶)相比,不同種類(lèi)生物酶處理對(duì)MEOs得率有顯著影響(P<0.05),其中復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶∶蛋白酶 =1∶1∶1)提取 MEOs的得率最高,達(dá)到(24.23±0.54)%,效果最差的是淀粉酶。其可能原因是在微波輔助水酶法提取過(guò)程中,番茄籽細(xì)胞壁及細(xì)胞間層的纖維素、蛋白質(zhì)和果膠質(zhì)形成的阻擋層己被纖維素酶和果膠酶有效破解,提高了油脂的溶出;同時(shí)蛋白酶滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi),以及蛋白酶對(duì)脂多糖、脂蛋白的分解作用,有利于油脂從復(fù)合體中釋放。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),復(fù)合酶能夠更好地瓦解細(xì)胞壁及其內(nèi)部結(jié)構(gòu),提高油料的提取率,比單酶的使用效果好[8,14-15]。
圖1 不同因素對(duì)MEOs得率的影響
在復(fù)合酶條件下,考察各因素對(duì)MEOs得率的影響。酶添加量不僅直接關(guān)系到提取率的高低,還涉及到生產(chǎn)成本等問(wèn)題[16]。由圖1b可知,隨著酶用量的增加,MEOs得率逐漸從12.6%增加到22.9%,但當(dāng)酶用量超過(guò)1.5%時(shí),MEOs得率增大不顯著。
升高溫度能夠提高反應(yīng)體系的活化能進(jìn)而提高反應(yīng)速率,但過(guò)高的溫度又會(huì)使酶失活,因此適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)溫度十分重要[17]。設(shè)定不同的反應(yīng)溫度,結(jié)果見(jiàn)圖1c。隨著酶解溫度的增大,MEOs先增大后降低,當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí)MEOs得率達(dá)到最大值21.5%,當(dāng)酶解溫度進(jìn)一步增加時(shí),MEOs得率降低;這可能是由于酶解溫度增高,提取體系分子運(yùn)動(dòng)加快,溶出速度也加快,有利于MEOs溶出;但酶解溫度過(guò)高,酶的活性降低,甚至失活,同時(shí)雜質(zhì)的溶出也增多。因此,選取45℃為酶解反應(yīng)的溫度。
由圖1d可知,隨著酶解時(shí)間的增大,MEOs得率先增大而后趨于平緩,但當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)70 min時(shí),MEOs得率增大不顯著。由圖1e可以看出,微波功率在100~500 W范圍內(nèi)升高,MEOs得率隨之提高,之后隨著酶添加量的增加,提取量不再繼續(xù)提高。隨著微波功率的提高,出油率增加,這是微波能量使細(xì)胞壁疏松甚至破裂、番茄籽細(xì)胞中蛋白質(zhì)變性等因素增加了細(xì)胞的通透性,以便于酶作用,從而提高了出油率。因此,選取400 W為合適的微波功率。
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert軟件中BBD設(shè)計(jì)方法,可獲得MEOs得率的四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(見(jiàn)表1)。對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知,MEOs得率影響因素中一次項(xiàng)A、B、C和D,交互項(xiàng)AC、BD、AD、BC和CD以及二次項(xiàng)A2、B2、C2和D2均表現(xiàn)出了顯著水平,僅交互項(xiàng)AB不顯著,即交互項(xiàng)AB對(duì)MEOs得率影響忽略不計(jì)(即回歸方程中剔除不顯著項(xiàng)),因此可建立如下二次回歸方程:
Y=24.73+1.87A+1.35B-1.91C+1.32D-1.37AC-2.67AD+3.74BC-1.32BD-2.94CD-4.20A2-1.23B2-2.07C2-1.66D2
表1 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果
從表2中還可以看出,二次回歸方程整體模型極顯著,并且失擬項(xiàng)不顯著,說(shuō)明該回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好地?cái)M合。進(jìn)一步對(duì)該回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),回歸方程決定系數(shù)R2和校正決定系數(shù)分別為0.950 3和0.900 7,均大于0.90,說(shuō)明模型相關(guān)度很好。
通過(guò)固定其他2個(gè)影響因素條件為“0”水平,對(duì)建立的預(yù)測(cè)MEOs得率回歸模型進(jìn)行降維分析,結(jié)果為酶添加量1.5%、溫度35℃、時(shí)間40 min、微波功率500 W,在此條件下MEOs得率預(yù)測(cè)值達(dá)到最大值29.65%。為了驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果提供方案的可行性,按響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證,將預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較并計(jì)算偏差,兩者偏差僅為1.72%,證明所得到擬合方程可以較好地描述工藝中各因素與評(píng)價(jià)指標(biāo)的關(guān)系。
表2 甜菜粗多糖得率回歸方程的方差分析表
MEOs與SEOs的理化特性如表3所示,其中折射率、皂化值和碘值等指標(biāo)與董海洲等[9]報(bào)道一致。MEOs與SEOs的折射率、比重、酸值、過(guò)氧化值(PV)和皂化值等指標(biāo)沒(méi)有顯著性差異,但MEOs的折射率略高于SEOs,可以得出其脂肪酸組成中含有大量不飽和雙鍵,具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[18];MEOs的碘值(127.15±0.93)gI/100 g油顯著高于 SEOs(116.34±0.82)gI/100 g油,同樣也說(shuō)明了 MEOs具有較高的不飽和脂肪酸。MEOs的酸值和PV低于SEOs,說(shuō)明MEOs具有較高的氧化穩(wěn)定性;MEOs的β-茴香胺值(p-AV)和共軛二烯烴(CD)均顯著低于SEOs,同樣說(shuō)明MEOs具有較高的氧化穩(wěn)定性。PV是油脂初始氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,大部分初始氧化產(chǎn)物都分解成酮醛等有害物質(zhì);而p-AV反映的是油脂氧化時(shí)二次氧化產(chǎn)物的含量,p-AV是評(píng)價(jià)油脂二次氧化最好的方法[19]。CD是不飽和脂肪酸的雙鍵被氧化而產(chǎn)生的初級(jí)氧化產(chǎn)物,常使用紫外吸收光譜測(cè)定在波長(zhǎng)232 nm共軛烯烴的含量來(lái)確定食用油氧化程度。CD和PV并不是同一種指標(biāo),通過(guò)對(duì)共軛烯烴的測(cè)定,能從微觀上更好的說(shuō)明 PV變化[20-21],所以通過(guò)對(duì)烯烴的測(cè)定能夠確定油脂高溫時(shí)氧化的程度。此外,MEOs中的總生育酚含量(901.31±10.33)mgα-生育酚/kg番茄籽油顯著高于SEOs中的含量(623.17±9.26)mgα-生育酚/kg番茄籽油,其可能原因在于微波輔助水酶法以機(jī)械和生物酶的手段來(lái)破壞番茄籽細(xì)胞壁,使其中生育酚得以釋放。
表3 MEOs和SEOs理化特性
表4 MEOs和SEOs脂肪酸組成
微波輔助水酶法和索氏法提取的番茄籽油脂肪酸組成見(jiàn)表4,MEOs和SEOs脂肪酸均主要由棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、α-亞麻酸(C18∶3)和花生酸(C20∶0)組成;其中MEOs飽和脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸和花生酸)總量低于索氏提取的番茄籽油,而不飽和脂肪酸(UFAs)總量高于SEOs,說(shuō)明在微波輔助水酶法提取過(guò)程中,不飽和脂肪酸甘油酯更容易被萃取出來(lái)。含量較高的UFAs有預(yù)防心血管疾病、延緩人體衰老等保健作用[22-23],作為一種富含 UFAs功能性油脂,MEOs具有很好的營(yíng)養(yǎng)保健功效,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較均衡。
1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·)是合成的以氮為中心的穩(wěn)定自由基,反應(yīng)容易控制,已廣泛應(yīng)用于各種植物提取物或純化合物的抗氧化活性的評(píng)價(jià)和篩選[24]。MEOs和SEOs清除DPPH·能力如圖2a所示,MEOs和SEOs清除DPPH·的活性具有相似的趨勢(shì),但MEOs清除DPPH·的能力均大于SEOs。由圖2b可知,MEOs和SEOs在β-胡蘿卜素-亞油酸測(cè)試體系中表現(xiàn)出差異的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力,二者均呈現(xiàn)量效關(guān)系,但MEOs抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力均強(qiáng)于SEOs,表現(xiàn)出與MEOs清除DPPH·相似的趨勢(shì)。MEOs抗氧化能力強(qiáng)于SEOs,其主要原因在于MEOs中含有較高的生育酚和不飽和脂肪酸,MEOs和SEOs抗氧化能力與其生育酚和不飽和脂肪酸含量具有較高的相關(guān)性。
圖2 MEOs和SEOs清除DPPH·和抗脂質(zhì)過(guò)氧化效果
3.1 微波輔助水酶法提取番茄籽油的最佳工藝條件是:復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶∶蛋白酶 =1∶1∶1)添加量1.5%、溫度34℃、時(shí)間40 min、微波功率500 W,在此條件下MEOs得率為29.65%。
3.2 MEOs與SEOs在理化特性方面沒(méi)有顯著區(qū)別,但MEOs含有較高的生育酚,同時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性,在DPPH·和β-胡蘿卜素-亞油酸測(cè)試體系中其IC50分別為9.52和10.64 mg/mL,說(shuō)明MEOs具有較高的氧化穩(wěn)定性和抗氧化能力,MEOs在食品工業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。
因此,利用微波輔助水酶法提取番茄籽油,方法操作和儀器設(shè)備簡(jiǎn)單,具有無(wú)毒、無(wú)害、可避免產(chǎn)物氧化等優(yōu)點(diǎn),是一種提取植物油脂的好方法。
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Microwave-Assisted Aqueous Enzymatic Extraction of Oil from Tomato Seed and Evaluation of Its Physicochemical Properties
Wang Qiang Wang Cun Wang Rui Ren Yanrong
(Department of biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067)
Response surfacemethodology has been applied to optimize the microwave-assisted aqueous enzymatic extraction of oil from tomato seeds(MEOs).The physicalchemical compositions,fatty acid compositions and antioxidant activities of MEOs have been compared with that features of soxhlet-extracted oil(SEOs).The optimal extraction conditionswas found to have enzyme concentration of1.5% (cellulase,pectinase and proteinase:1∶1∶1),temperature of 35℃,time of 40 min and irradiation power of 500 W.On the conditions,the extraction yield of MEOs could reach 29.65%.Moreover,there were no significant variations in physicochemical properties of MEOs and SEOs,while MEOs had the higher tocopherols and exhibited the better oxidation stability.MEOs showed the stronger antioxidant activitieswith IC50values of9.52 and 10.64 mg/mL according to DPPH radical scavenging assay andβ-carotene/linoleic acid bleaching test.MEOs shall be a fine nutritionalmaterial which has wide prospects in health food fields.
tomato seed oil,microwave-assisted aqueous enzymatic extraction,physicochemical properties,antioxidant activity
TS214.2
A
1003-0174(2015)10-0043-07
重慶市應(yīng)用開(kāi)發(fā)計(jì)劃(cstc2014yykfA80009),重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃(KJTD201325)
2014-05-09
王強(qiáng),男,1982年出生,副教授,油脂化學(xué)、抗氧化自然資源利用與生理生化