肖紅衛(wèi)　華再東　張立蘋　任紅艷　劉西梅　華文君　李莉　畢延震　鄭新民

摘要：為了觀察17-β-雌二醇對豬卵母細胞體外成熟及體外受精胚的影響，選用屠體卵巢上的卵母細胞為試驗材料，將其分為4組，分別在培養(yǎng)基中添加 0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇，體外成熟培養(yǎng)時間為36～44 h，受精胚培養(yǎng)時間為9 d。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中分別添加17-β-雌二醇0、25、50、75 μmol/L時豬卵母細胞體外成熟率分別為58.5%、67.1%、80.9%、64.5%，卵裂率分別為51.2%、56.5%、63.5%、59.2%，囊胚形成率分別為16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。結(jié)果顯示在培養(yǎng)基中添加50 μmol/L 17-β-雌二醇可提高豬卵母細胞體外成熟率至80.9%，提高體外受精胚的卵裂率至63.5%，但囊胚形成率以添加量為25 μmol/L的組最高，說明添加17-β-雌二醇可提高豬卵母細胞成熟率、卵裂率以及囊胚率。

關(guān)鍵詞：17-β-雌二醇；卵母細胞；體外成熟；體外受精；胚胎培養(yǎng)

中圖分類號：S828.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5660-02

Abstract： For observing the effect of 17-β-E2 on the porcine oocytes maturation and fertilized embryos development in vitro， the porcine oocytes collected from prepubertal gilts ovaries were cultured in maturation medium which added different concentration 17-β-estrodiol （0、25、50、75 μmol/L） for 36～44 hours. The fertilized eggs were cultured for 9 days. The results showed that the maturation rate of each addition was 58.5%， 67.1%， 80.9%， 64.5%， respectively. The cleavage rate was 51.2%， 56.5%， 63.5%， 59.2%， respectively， and the blastocyst rate was 16.7%， 24.2%， 19.5% and 24.0%， respectively. It indicated that the addition of 17-β-estrodiol could improve maturation rate， cleavage rate and blastocyst rate， and the maturation rate & cleavage rate of 50 μmol/L addition were higher than the other 3 groups， but the blastocyst rate of 25 μmol/L addition was higher than the other groups.

Key words： 17-β-estrodiol；porcine oocytes； in vitro maturation； in vitro fertilization； embryo culture

自Mattiol等[1]用屠體的卵母細胞獲試管豬以來，卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)已經(jīng)取得了較大的進展[2]。目前，研究者大多從屠宰場廢棄卵巢中獲取卵母細胞，但隨著中國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，生豬出欄時間從原來的5個月縮短到3個月，而3月齡的母豬尚未性成熟。因此，如何進一步提高卵母細胞的成熟效率，為胚胎工程技術(shù)準備更多優(yōu)良的成熟卵母細胞就日益成為研究者所關(guān)注的焦點[3，4]。

雌二醇（E2）是體內(nèi)主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進和調(diào)節(jié)性器官及副性征的正常發(fā)育，臨床用于卵巢機能不全或卵巢激素不足引起的各種癥狀。本試驗在豬卵母細胞的成熟培養(yǎng)基中添加不同濃度的雌二醇，以研究其添加量對卵丘細胞體外成熟率的影響及對體外受精胚發(fā)育率的影響，旨在為胚胎工程技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

除特別標識外，所有試劑均購自Sigma公司，耗材為NUNC公司產(chǎn)品。

1.1 卵巢的采集、運輸、清洗及修剪

本試驗所用卵巢來自武漢市中糧肉食品加工廠屠宰場。剪下剛屠宰的直徑約1.0～2.5 cm、卵泡顏色清亮、形態(tài)正常（無過大、病變卵泡）且手感尚溫的卵巢（剪去卵巢上附帶的輸卵管和系膜），放入加有雙抗的35～38 ℃的滅菌生理鹽水中，在2 h內(nèi)送回實驗室。隨后用等溫生理鹽水沖洗2～3次至無血水。

1.2 卵母細胞的采集

用帶有18 G針頭的注射器抽取卵巢表面卵泡（2～6 mm），將抽取液注入50 mL離心管（離心管置于38 ℃的水浴鍋中）中。待卵丘-卵母細胞復合體（COCs）沉淀后在立體顯微鏡下檢卵。選取帶有致密卵丘細胞的卵母細胞并對所得細胞進行分級比較。將檢出的COCs用加有雙抗的DPBS 洗滌3次，然后用卵母細胞操作液洗滌3次，移入當天上午在CO2培養(yǎng)箱中平衡的成熟培養(yǎng)液中。卵母細胞的培養(yǎng)采用四孔板培養(yǎng)法：每孔400 μL的培養(yǎng)體系內(nèi)放入80枚卵，在5%CO2、95%空氣、38.5 ℃飽和濕度下培養(yǎng)36～44 h。

1.3 卵母細胞體外成熟情況的檢查

培養(yǎng)結(jié)束后，檢查卵丘擴散情況，再將卵母細胞移至0.1%透明質(zhì)酸酶溶液中，渦漩振蕩法脫去卵丘細胞并在顯微鏡下檢查極體排出情況。

1.4 體外受精

將培養(yǎng)成熟的卵母細胞用透明質(zhì)酸酶除去其外面的卵丘細胞。挑選胞質(zhì)飽滿均勻、有第一極體的卵母細胞移入到預平衡的獲能液中洗滌 3～5次。然后用移卵管移入上蓋礦物油并在CO2培養(yǎng)箱中預孵1 h以上的受精液微滴中（50 μL），每滴放入10～15枚卵母細胞，置于 CO2培養(yǎng)箱（38.5 ℃、5%CO2、100%飽和濕度）中，等待受精。

將已經(jīng)獲能的精子，調(diào)整精子濃度到2×106個/mL左右。然后取50 μL加入到等待受精的卵母細胞微滴中，于CO2培養(yǎng)箱（38.5 ℃、5%CO2、100%飽和濕度）中，共同孵育6 h。

1.5 胚胎培養(yǎng)

受精6 h后，將卵母細胞移入NCSU23中輕輕吹打，去除附著在受精卵周圍的精子，并用 NCSU23 洗滌3次，然后放入至少平衡2 h的NCSU23微滴（4 μg/mL BSA）中，每滴約10枚受精卵，培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5%CO2、100%飽和濕度。受精當天記為第0天，第二天檢查卵裂情況，第六天檢查囊胚發(fā)育情況。

1.6 試驗設(shè)計

1.6.1 不同濃度17-β-雌二醇對卵母細胞成熟的影響 用以下配方對卵母細胞進行體外產(chǎn)生培養(yǎng)，36～44 h后，以出現(xiàn)第一極體者（pbⅠ）判為卵母細胞成熟，比較不同雌二醇添加濃度對卵母細胞成熟的影響。

mTCM199配方： TCM-199（Gibco）添加3.05 mmol/L葡萄糖、0.91 mmol/L丙酮酸鈉、0.57 mmol/L L-半胱氨酸、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL硫酸鏈霉素、10%（V/V）卵泡液、10 IU/mL孕馬血清促性腺激素（PMSG）和10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素（hCG）。

試驗設(shè)置4個處理，分別為處理1：mTCM199+0 μmol/L 17-β-E2；處理2：mTCM199+25 μmol/L 17-β-E2；處理3：mTCM199+50 μmol/L 17-β-E2；處理4：mTCM199+75 μmol/L 17-β-E2。

1.6.2 不同雌二醇添加濃度對體外受精胚發(fā)育的影響 用NCSU23培養(yǎng)基對體外受精胚進行體外培養(yǎng)，出現(xiàn)卵裂后進行計數(shù)，并在出現(xiàn)囊胚后統(tǒng)計囊胚的數(shù)量，比較不同雌二醇添加濃度對體外受精胚發(fā)育的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雌二醇添加濃度對卵母細胞成熟的影響

由表1可見，在成熟液中添加0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇的卵母細胞的成熟率分別為58.5%、67.1%、80.9%、64.5%。結(jié)果表明，成熟液中添加50 μmol/L17-β-雌二醇可提高卵母細胞的成熟率。

2.2 不同雌二醇添加濃度對體外受精胚發(fā)育的影響

由表1可見，在成熟液中添加0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇的卵母細胞的體外受精胚卵裂率分別為51.2%、56.5%、63.5%、59.2%；第六天的囊胚率分別為16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。表明在培養(yǎng)基中添加50 μmol/L17-β-雌二醇組的卵裂率最高，但在囊胚形成率上以添加25 μmol/L17-β-雌二醇組最高，說明17-β-雌二醇在卵母細胞成熟上起作用，不同濃度的處理對后期胚胎發(fā)育的影響不同。

3 小結(jié)與討論

有關(guān)雌二醇在卵母細胞成熟中的作用有許多報道，但是對于不同物種得出的結(jié)論不一致[5-7]。李凱等[5]研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇對小鼠卵母細胞的成熟及其發(fā)育潛力無明顯作用。呂麗華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中，添加1 μg/mL雌二醇更有利于卵母細胞體外成熟培養(yǎng)，可使卵裂率提高17.6%。李繼鵬等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加濃度為2.0 μg/mL的雌二醇可促進犬卵母細胞核成熟到MⅠ-MⅡ期，但效果并不明顯。戈力等[8]研究發(fā)現(xiàn)，成熟液中添加1 μg/mL雌二醇對豬卵母細胞的體外成熟具有明顯的促進作用，而添加100 μg/mL 雌二醇對豬卵母細胞體外成熟具有明顯的抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，添加17-β-雌二醇可提高豬卵母細胞成熟率、卵裂率及囊胚率；但對于受精后的卵裂率，其中以添加50 μmol/L 17-β-雌二醇組效果最好，可促進豬卵母細胞的成熟，提高受精后胚胎的發(fā)育能力。

參考文獻：

[1] MATTIOLI M，BACCI M L，GALEATI G，et al.Developmental competence of pig ooctyes matured and fertilized in vitro[J].Theriogenology，1989，31（6）：1201-1207.

[2] 秦鵬春，譚景和，吳光明，等.豬卵巢卵母細胞體外成熟與體外受精的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學，1995，28（3）：58-66.

[3] 孟慶剛，張成林，張永忠，等.豬小腔卵泡卵母細胞體外成熟研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2001，32（3）：213-219.

[4] 張 涌，劉素娟.山羊小腔卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)和體外受精[J].西北農(nóng)業(yè)大學學報，1996（4）：12-16.

[5] 李 凱，趙雁偉，郭 勇，等.雌二醇和孕酮對小鼠卵母細胞體外成熟的影響[J].中國實驗動物學報，2008，16（4）：293-297.

[6] 呂麗華，李富忠，岳文斌.成熟液中添加不同濃度雌二醇對山羊卵母細胞成熟的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（12）：37-38.

[7] 李繼鵬，尹熙俊，崔成都，等.雌二醇對犬卵母細胞體外成熟的影響[J].延邊大學農(nóng)學學報，2013，35（2）：152-155.

[8] 戈 力，張運海，陶 勇，等.不同濃度雌二醇對豬卵母細胞體外成熟和孤雌激活胚胎的影響[J].畜牧與飼料科學，2011， 32（12）：9-11.

（責任編輯 曾德芳）