蘭麗盼，朱偉，吳小鋒，黃美紅，朱建忠

（1.桐鄉(xiāng)市蠶業(yè)管理站，浙江桐鄉(xiāng) 314500；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒對(duì)家蠶的感染性分析

蘭麗盼1，朱偉1，吳小鋒2，黃美紅1，朱建忠1

（1.桐鄉(xiāng)市蠶業(yè)管理站，浙江桐鄉(xiāng) 314500；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒作為一種新型微生物源低毒殺蟲劑，能夠防治大多數(shù)鱗翅目昆蟲并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，它對(duì)同屬于鱗翅目昆蟲的家蠶是否具有感染性是該生物農(nóng)藥在桑保和蠶區(qū)植保上推廣的關(guān)鍵。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒；家蠶；感染性

桿狀病毒是一類特異感染節(jié)肢動(dòng)物的病毒，呈桿狀，在感染細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，能夠感染大部分鱗翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）和家蠶核型多角體病毒（Bm-NPV）分別是桿狀病毒科核型多角體病毒屬多粒包埋型和單粒包埋型的兩個(gè)代表種，兩者除了應(yīng)用于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)外，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒還作為一種新型微生物源低毒殺蟲劑，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治［1～3］。

生物農(nóng)藥是當(dāng)前農(nóng)作物病蟲害綜合防治所提倡推廣應(yīng)用的安全防治方法，具有生態(tài)安全性和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等優(yōu)點(diǎn)，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要內(nèi)容。雖然苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒能夠防治大多數(shù)鱗翅目昆蟲，但桐鄉(xiāng)市桑保和植保上卻沒有推廣應(yīng)用，推測(cè)可能對(duì)同屬于鱗翅目的家蠶具有感染性。Guo等的研究表明AcMNPV可以感染家蠶的某些品種，如54A、皓月和蘭10等［3］。本文主要探討Ac-MNPV能否在桐鄉(xiāng)市桑保和植保上推廣應(yīng)用，因此本實(shí)驗(yàn)選用的是我市當(dāng)家蠶品種秋豐×白玉。

1 材料和方法

1.1 材料

家蠶品種為秋豐×白玉，23～25℃條件下普通桑葉飼育，桐鄉(xiāng)市蠶業(yè)有限公司繁育；家蠶細(xì)胞（BmN）和草地貪夜蛾細(xì)胞（Sf9）由浙江大學(xué)吳小鋒教授實(shí)驗(yàn)室提供，分別于35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁生長，細(xì)胞密度9×105/皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，溫度27～28℃；設(shè)立陰性對(duì)照，細(xì)胞內(nèi)毒素檢查用無菌水，廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；陽性對(duì)照，為野生型BmNPV，病毒滴度1×106pfu/ml，試驗(yàn)用樣品，AcMN-PV，病毒滴度1×106pfu/ml，上述兩種病毒均由浙江大學(xué)吳小鋒教授實(shí)驗(yàn)室提供；無菌注射器，為圣貝諾醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品。

表1 AcMNPV病毒對(duì)家蠶細(xì)胞的感染試驗(yàn)Table 1Experiment on the infection of AcMNPV virus in silkworm cells

表2 AcMNPV病毒對(duì)家蠶的感染試驗(yàn)Table 2Experiment on the infection of AcMNPV virus in silkworm

1.2 病毒感染家蠶細(xì)胞

無菌條件下用無菌注射器分別吸取10 μl的陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和AcMNPV三個(gè)種樣品，感染家蠶（BmN）細(xì)胞；另增加一個(gè)陽性對(duì)照，即吸取10 μl AcMNPV感染Sf9細(xì)胞，感染后將細(xì)胞置于27～28℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，顯微鏡下觀察家蠶細(xì)胞和Sf9細(xì)胞的感染情況。

1.3 病毒經(jīng)皮感染四齡起蠶

四齡起蠶放置在4℃冰箱數(shù)分鐘，然后將不同處理用注射器從幼蟲腹部節(jié)間膜處穿刺接種，穿刺時(shí)針頭平行插入且輕推針筒，注意不傷其內(nèi)部器官。每頭幼蟲注射量30 μl，接種30 min后再飼喂桑葉。不同處理重復(fù)三組，每組試驗(yàn)10頭蠶。

2 結(jié)果

2.1 病毒感染家蠶細(xì)胞

桿狀病毒是一類以昆蟲細(xì)胞為天然宿主的雙鏈DNA病毒，具有高度的種屬特異性，不感染脊椎動(dòng)物，對(duì)人、畜無害。AcMNPV的宿主主要是草地貪夜蛾，其細(xì)胞為Sf9；BmNPV的宿主是家蠶，其細(xì)胞為BmN，都可以用來包裝擴(kuò)增桿狀病毒并表達(dá)蛋白。BmNPV感染家蠶細(xì)胞的典型癥狀與AcMNPV感染Sf9細(xì)胞的典型癥狀相似，肉眼可見細(xì)胞增殖明顯變慢或不增殖，細(xì)胞開始變大，隨后細(xì)胞脫落不貼壁，最后裂解。實(shí)驗(yàn)表明，BmNPV對(duì)家蠶細(xì)胞有明顯的感染效果，AcMNPV對(duì)Sf9也有明顯的感染效果，但對(duì)家蠶細(xì)胞的感染肉眼無法觀察判斷（表1）。

2.2 病毒經(jīng)皮感染四齡起蠶

BmNPV是家蠶血液型膿病的病原，受BmNPV感染的家蠶發(fā)病后體軀腫脹，體色乳白，常爬至蠶座邊緣，皮膚破裂流出膿汁后死亡，組織液化黑化。根據(jù)Guo等的報(bào)道，BmNPV感染的家蠶會(huì)出現(xiàn)造成宿主組織的液化和黑化，AcMNPV感染家蠶后不會(huì)造成家蠶宿主組織的液化和黑化［3］。

3 分析

BmN細(xì)胞來源于家蠶的卵巢細(xì)胞［4］，Sf9細(xì)胞來源于草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞［5］。表1可知，AcMNPV感染Sf9細(xì)胞癥狀明顯，然而感染BmN細(xì)胞肉眼沒有觀察到明顯感染癥狀，原因可能是AcMNPV病毒在家蠶卵巢細(xì)胞內(nèi)復(fù)制緩慢，導(dǎo)致家蠶卵巢細(xì)胞感染癥狀輕微以致肉眼難以觀察［6］。

本文AcMNPV感染家蠶采用無菌穿刺方法。根據(jù)表2結(jié)果可知，用AcMNPV穿刺接種四齡起蠶，大部分實(shí)驗(yàn)家蠶未經(jīng)大眠上蔟結(jié)繭，即從四眠品種變?yōu)槿咝Q。原因可能是AcMNPV基因組中有一編碼蛻皮甾體尿苷二磷酸葡糖轉(zhuǎn)移酶的基因egt，egt基因是桿狀病毒非必需的早期基因。AcMNPV感染蟲體后，egt的表達(dá)使昆蟲體的蛻皮激素失活，干擾和阻礙了受染宿主的正常發(fā)育進(jìn)程，抑制了幼蟲的蛻皮與變態(tài)［7］。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒作為一種新型生物農(nóng)藥，也有著生物農(nóng)藥共有的弱點(diǎn)：①防治機(jī)理是通過感染害蟲誘發(fā)患病，防治效果較為緩慢；②有效活性成分易受環(huán)境因素的制約和干擾，質(zhì)量穩(wěn)定性差；③生產(chǎn)成本高，農(nóng)民難以接受［8］。另外市場(chǎng)上的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒農(nóng)藥一般都和其他化學(xué)農(nóng)藥配比以提高藥效，目前中國農(nóng)藥信息網(wǎng)上登記的AcMNPV農(nóng)藥有四種，2015年春蠶期筆者購買其中一種AcMNPV農(nóng)藥進(jìn)行對(duì)家蠶的毒性試驗(yàn)，添食第二天家蠶全部中毒死亡，原因是該農(nóng)藥其有效成分除AcMNPV外還添加了對(duì)家蠶劇毒的甲維鹽。綜上可見，市場(chǎng)上銷售的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒雖在植保上應(yīng)用較廣，防治效果較好，但在桑保和蠶區(qū)植保上尚難以推廣應(yīng)用。

通過實(shí)驗(yàn)，本文初步探討了AcMNPV對(duì)桐鄉(xiāng)市當(dāng)家蠶品種秋豐×白玉的感染情況，為桐鄉(xiāng)市桑保和植保中是否利用AcMNPV生物殺蟲劑的決策提供了理論參考。

［1］薛貴收，肖娛玉，朱江，等.昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究與應(yīng)用進(jìn)展［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（2）：8～11.

［2］齊江衛(wèi)，王培丹，張珂，等.苜蓿銀紋夜蛾病毒殺蟲劑對(duì)橄欖甜菜夜惡的田間防效［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（6），143～144.

［3］彭偉，陳愛春，汪生鵬.重組AcMNPV感染家蠶后造成宿主組織液化的機(jī)制分析［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2012，38（4）：680～687.

［4］普孝英，洪錫鈞，陳敏，等.BmN細(xì)胞有絲分裂及其染色體的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2003，29（2），136～141.

［5］FU Yue-Jun，ZHAO Jie，LIANG Ai-Hua，et al.AcMNPV-mediatied expression of BmK IT protomtes the apoptosis of Sf9 cells and replication of AcMNPV［J］.Acta Physiologica Sinica，2015，67（3），305～311.

［6］莊蘭芳，張翌，張惠展，等.重組AcMNPV載體攜帶的外源基因在家蠶中的動(dòng)態(tài)表達(dá)［J］.藥物生物技術(shù)，2008，15（5），331～336.

［7］彭建新，陳曲侯.桿狀病毒egt基因的結(jié)構(gòu)功能與表達(dá)［J］.病毒學(xué)報(bào)，1994，10（1），93～95.

［8］郭榮.我國生物農(nóng)藥的推廣應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展策略［J］.中國生物防治學(xué)報(bào)，2011，27（1），124～127.

Infectivity Analysis of Autographa Californica Nuclear Polyhedrosis Virus in Silkworm

LAN Li-pan1,ZHU Wei1,WU Xiao-feng2,HUANG Mei-hong1,ZHU Jian-zhong1
（1.Tongxiang Sericulture Management Station,Jiaxing 314500 Zhejiang,China; 2.College of animal science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcMNPV)is a new type of microbial source of low toxicity pesticides that can control the majority of lepidopteran insects and is widely used in agricultural production.Whether it has infectivity in silkworm is the key to the promotion and protection of biological pesticides in mulberry silkworm area on plant protection.

AcMNPV;silkworm;infectivity

S884.5

A

0258-4069［2015］04-028-03

蘭麗盼（1983-），女，山東青島人，碩士，農(nóng)藝師。主要從事蠶保和蠶桑技術(shù)推廣。E-mail：lanlipan@126.com。