蔡海鵬林寶東黃厚沐

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其細(xì)胞因子在弱精子癥患者的表達(dá)與臨床意義

蔡海鵬①林寶東①黃厚沐①

目的：觀察CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在弱精癥不育患者變化規(guī)律以及與精子質(zhì)量的相關(guān)性。方法：收集60例弱精癥不育患者為觀察組及36例健康志愿者為對(duì)照組，收集其外周血及前列腺液標(biāo)本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血及前列腺液內(nèi)（Treg）及其胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）及白介素10（IL-10）含量，并分析以上三者與精子活力及活率的相關(guān)性。結(jié)果：觀察組患者外周血及前列腺按摩液Treg、IL-10及TGF-β1均顯著低對(duì)照組（P＜0.05）；Treg與精子密度、活力及性激素水平之間均呈正相關(guān)性（r＞0.075，P＜0.05）。兩組精液量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），觀察組精子活率、運(yùn)動(dòng)速度和ATP含量指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，CD4+CD25+Treg、TGF-β1和IL-10與精子活率、畸形率、運(yùn)動(dòng)速度、精子ATP指標(biāo)之間均呈正相關(guān)性。結(jié)論：CD4+CD25+Treg免疫異常所致的精子的免疫性破壞過(guò)度，可能是弱精癥不育癥的重要免疫學(xué)機(jī)制。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞； 弱精癥； 免疫破壞； 免疫抑制細(xì)胞因子

近年報(bào)道弱精癥導(dǎo)致不育的案例越來(lái)越多，該類患者甚至連慢性前列腺炎的病史都不具備，其機(jī)制不明，因此給治療帶來(lái)困難。有研究表明免疫因素可能是弱精癥的重要發(fā)病機(jī)制[1]。國(guó)外有報(bào)道CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）與不育癥相關(guān)，但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于弱精癥患者Treg變化的研究不多。因此筆者以此為切入點(diǎn)，重點(diǎn)觀察了弱精癥與健康成年男性外周血Treg及血常規(guī)的變化，發(fā)現(xiàn)弱精癥患者Treg數(shù)量明顯降低，且與Treg功能密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10及TGF-β1亦表現(xiàn)為數(shù)量不足。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究以2013年1月-2014年12月本院泌尿外科門(mén)診及病房接診的60例弱精子癥患者為觀察組，平均年齡（35.3±9.3）歲，平均病程（5.6±1.5）年。入選標(biāo)準(zhǔn)如下：所有患者均為婚后性生活正常，未采取任何避孕措施而不育1年以上，女方生育力檢查正常，男方無(wú)生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、無(wú)生殖系統(tǒng)感染、無(wú)精索靜脈曲張、精道梗阻、逆行射精或不射精等疾?。痪簠?shù)中前向運(yùn)動(dòng)的精子（a和b級(jí)）＜50％或a級(jí)運(yùn)動(dòng)的精子＜25％的異常情況。36例健康志愿者來(lái)自本院體檢中心為對(duì)照組，平均年齡（32.7±11.5）歲，經(jīng)健康體檢已排除泌尿生殖系統(tǒng)及其他疾病[2-3]。以上觀察對(duì)象均同意靜脈抽血及前列腺按摩檢查，兩組的一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 鼠抗人CD4-FITC單抗，CD25-PE單抗及同型對(duì)照IgGI-FITC，IgG -PE，均為B&D公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀為Beckman公司產(chǎn)品（型號(hào)：EPICSXL）。IL-10及人TGF-β1的血清及前列腺液ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。淋巴細(xì)胞分離液（AXIS-SHIELD公司）、RT-PCR試劑盒及Tregizol RNA提取試劑盒均購(gòu)自武漢博士得生物科技有限公司，PE9600型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)PE公司）[2]。

1.3 標(biāo)本采集 外周血：清晨采集以上觀察對(duì)象的靜脈血約2.0 mL，采用肝素鈉抗凝；精液：采用手淫法采集精子約1～3 mL，采用肝素鈉抗凝；前列腺液：采用前列腺按摩法，采集前列腺液約0.5～1.0 mL，采用肝素鈉抗凝[4-7]。

1.4 檢測(cè)方法 外周血：采用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用含10％小牛血清的RPMI-1640調(diào)細(xì)胞至106/mL，取200 μL細(xì)胞分別加入抗CD4-FITC、抗CD25-PE的單克隆抗體各20 μL，同型對(duì)照分別為IgG1-FITC、IgG-1-PE，混勻后避光孵育25～30 min，PBS洗滌2次。將細(xì)胞懸浮于0.5 mL PBS洗滌液中，振蕩混勻后上機(jī)檢測(cè)[3]。同法檢測(cè)前列腺液及外周血IL-10、及TGF-β1的含量。精液：使用精子質(zhì)量分析儀檢測(cè)存活率、平均運(yùn)動(dòng)速度、精子活力指數(shù)等指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件包SAS 8.1對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用（±s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊者采用t檢驗(yàn)比較組間差異，不符合正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)，指標(biāo)之間的相關(guān)性分析采用Pearson參數(shù)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Treg及細(xì)胞因子比較 觀察組患者外周血CD4+CD25+Treg、外周血及前列腺液的TGF-β1和IL-10均顯著低于對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。在CD4+CD25+Treg的基因表達(dá)含量方面，兩組的Foxp3有差異。組間比較顯示，兩組患者的外周血及前列腺液IL-10及TGF-β1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患者Treg及細(xì)胞因子比較（±s） ％

表1 兩組患者Treg及細(xì)胞因子比較（±s） ％

TGF-β1組別TregIL-10外周血前列腺液外周血前列腺液觀察組（n=60）2.72±0.332.38±0.681.81±0.223.61±1.832.76±1.03對(duì)照組（n=36）5.18±0.973.92±1.192.21±1.345.92±2.914.65±0.82 t值-2.393-5.121-2.732-3.526-2.887 P值0.0260.0250.0060.0030.005

2.2 兩組精液常規(guī)比較 兩組精液量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；觀察組精子活率、運(yùn)動(dòng)速度和ATP含量指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組精液常規(guī)比較（±s）

表2 兩組精液常規(guī)比較（±s）

*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別精液量（mL）活率（％）運(yùn)動(dòng)速度（μmol/s）ATP（μmol/dL）觀察組（n=60）2.38±0.41 35.41±14.28*15.83±4.42*3.45±1.98*對(duì)照組（n=36）2.52±0.3562.28±13.5534.66±2.947.03±2.49

2.3 相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，CD4+CD25+Treg、TGF-β1和IL-10與精子活率、畸形率、運(yùn)動(dòng)速度、精子ATP指標(biāo)之間均呈正相關(guān)性（r＞0.075，P＜0.05）。

3 討論

弱精子癥占所有男性不育致病因素的半數(shù)以上，引發(fā)弱精子癥的原因很多，主要有生殖道感染、免疫因素、精索靜脈曲張、內(nèi)分泌因素以及先天性疾病等[4-9]。目前弱精子癥的免疫發(fā)病機(jī)制尚未明確，是其治療效果欠佳的主要原因之一。Treg細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一群具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的抑制性T細(xì)胞[4]。本研究從T細(xì)胞免疫學(xué)角度研究弱精子癥患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其細(xì)胞因子的表達(dá)，總結(jié)弱精子癥患者Treg及其細(xì)胞因子的變化規(guī)律，以及弱精子癥患者CD4+CD25+Treg及其細(xì)胞因子含量與精子質(zhì)量的相關(guān)性[10]。研究結(jié)果表明，觀察組外周血CD4+CD25+Treg的含量顯著低于對(duì)照組，外周血的TGF-β1和IL-10顯著低于對(duì)照組；觀察組前列腺液的TGF-β1和IL-10顯著低于對(duì)照組；外周血的TGF-β1和IL-10均顯著高于前列腺液；兩組精液量比較差異無(wú)顯著性；觀察組精子活率、運(yùn)動(dòng)速度和ATP含量指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組；經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，CD4+CD25+Treg、TGF-β1和IL-10與精子活率、畸形率、運(yùn)動(dòng)速度、精子ATP指標(biāo)之間均呈正相關(guān)性。

CD4+CD25+Treg在前列腺的免疫失衡中起到重要作用[11]。Treg活化后不僅能抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖，還可抑制組織內(nèi)由于T細(xì)胞免疫殺傷過(guò)度所致的免疫性損傷，因此Treg具有下調(diào)及抑制免疫的功能[12]。Foxp3是一個(gè)重要的蛋白，其可促使初始（未成熟）T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化，因此Foxp3是Treg的主要功能因子，前者的減少可導(dǎo)致Treg功能的缺陷[5]。在Treg所分泌的細(xì)胞因子中，IL-10與TGF-β1所占的位置最為重要：TGF-β1可促進(jìn)Foxp3基因的克隆表達(dá)，而后者是發(fā)揮免疫抑制功能的主要功能因子[13-14]。除TGF-β1外，作為白介素家族重要成員的IL-10，具有抑制炎性反應(yīng)、預(yù)防自身免疫現(xiàn)象出現(xiàn)的生物學(xué)作用，因此缺乏IL-10可導(dǎo)致一系列自身免疫病如腸炎或腦脊髓膜炎（EAE）的發(fā)生[15]。

本文以上述背景為理論依據(jù)，從免疫調(diào)節(jié)的角度觀察弱精癥的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)直接檢測(cè)外周血Treg數(shù)量發(fā)現(xiàn)該T細(xì)胞在弱精癥患者的表達(dá)明顯降低，且發(fā)現(xiàn)外周血及前列腺液當(dāng)中該細(xì)胞的功能因子TGF-β1及IL-10均顯著降低，這進(jìn)一步印證了不論在全身抑或前列腺組織局部，都表現(xiàn)為T(mén)reg數(shù)量的減少及功能的不足。其原因可能是：弱精癥患者降低使IL-10不足以抑制單核細(xì)胞的活化與增值，導(dǎo)致單核細(xì)胞過(guò)度執(zhí)行抗原提呈功能，后者致使外周血及前列腺局部的免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，使前列腺導(dǎo)管和腺泡不斷受到免疫損害而導(dǎo)致生精功能減退等臨床表現(xiàn)[14]。

綜上所述，對(duì)于弱精子癥患者而言，CD4+CD25+Treg含量和功能的異常，導(dǎo)致TGF-β1和IL-10細(xì)胞因子減少進(jìn)而引發(fā)免疫抑制功能下降，導(dǎo)致了前列腺的免疫反應(yīng)過(guò)強(qiáng)產(chǎn)生了抗精子抗體，影響精子的活動(dòng)能力、運(yùn)動(dòng)能力以及穿透能力。因此，CD4+CD25+Treg免疫異常是弱精子癥發(fā)病的重要影響因素。

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Expression and Clinical Significance of Regulatory T Cells and Cytokines in the Asthenospermia

CAI Haipeng，LIN Bao-dong，HUANG Hou-mu.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：027-029

Objective： To observe the change pattern of CD4+CD25+regulatory T cells （Treg） in asthenospermia infertile patients and the correlation with sperm quality.Method： The peripheral blood and prostatic fluid specimens were collected from 60 asthenospermia infertile patients as the observation group and 36 healthy volunteers as the control group. The flow cytometry was used to determine the volume of Treg， intracellular transforming growth factor β1 （TGF-β1）and interleukin 10 （IL-10） in the peripheral blood and prostatic fluid.The correlation of the above three substances of sperm viability and motility rate were analysed.Result：Compared with control group，the observation group patients of Treg， IL-10 and TGF-β1 asthenospermia infertile had significantly lower volume in their peripheral blood and prostate massage fluid，the differences were statistically significant（P＜0.05）.There was positive correlation between Treg and sperm density， vitality and sex hormone levels separately（r＞0.075，P＜0.05）.There was no significant difference in the sperm volume of the two groups. The sperm motility rate， sperm velocity and ATP of the observation group were all obviously lower than those of the control group， the difference was statistically significant（P＜0.05）. The Pearson method was used， CD4+CD25+Treg，TGF-β1 and IL-10 had positive correlation with the index of sperm motility rate，malformation，velocity，and ATP.Conclusion：The dysimmunity of CD4+CD25+Treg， which causes excessive damage to the sperm immunity， is possibly an important immunological mechanism of the asthenospermia infertility.

Regulatory T cells； Asthenospermia； Immunity damage； Immunosuppressive cytokines

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.009

2015-01-13） （本文編輯：周亞杰）

①?gòu)V東省汕頭市潮陽(yáng)區(qū)大峰醫(yī)院 廣東 汕頭 515100

林寶東

First-author’s address：Shantou Chaoyang District Dafeng Hospital，Shantou 515100，China