李葉青，皮小弟，許洪勇，成 蓮，曾石峭

(1.廣東省河源市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)所，廣東河源 517000;2.廣東省河源市食品藥品監(jiān)督檢測(cè)所，廣東河源 517000)

黃樟素(safrole)(CAS:94-59-7)又稱黃樟油素、黃樟腦，無(wú)色或微黃色液體，不溶于水，易溶于氯仿，乙醚和其他非極性有機(jī)溶劑［1－2］，有樟木氣味，天然存在于肉桂、肉豆蔻、黑胡椒和紫蘇等植物中，是許多食用天然精油如黃樟精油、八角精油和樟腦油的主要成分。由于其舒適的氣味，黃樟油曾經(jīng)在食品、洗滌用品和化妝品中作為調(diào)味劑和調(diào)香劑［3］。

黃樟素類化合物主要包括黃樟素、異黃樟素和二氫黃樟素等。黃樟素用來(lái)合成胡椒基丁醚和胡椒醛，胡椒基丁醚是農(nóng)藥的增效劑，胡椒醛用來(lái)調(diào)味，是香料的組分［4－5］。黃樟素也是非法生產(chǎn)毒品——搖頭丸的一個(gè)重要組成部分［6］。異黃樟素和二氫黃樟素是黃樟素的衍生物，異黃樟素是黃樟素在氫氧化鉀－無(wú)水乙醇溶液中加熱異構(gòu)化的產(chǎn)物，有類似茉莉醛的氣息，香氣強(qiáng)烈而持久;二氫黃樟素由黃樟素氫化而得，是合成農(nóng)藥增效醚的重要中間體，具有黃樟素類似的香氣。

許多常見(jiàn)的香料，包括黑胡椒、可可、肉豆蔻、肉桂、龍蒿、八角、茴香、香菜、西芹、月桂、小茴香、香果和丁香都含有微量的黃樟素［7－8］。使用上述香料的軟飲料中黃樟素的檢出限為3～5 mg/L，可口可樂(lè)和百事可樂(lè)也包含其中［9］;酒精飲料含有0.15 ～3.00 mg/L［10］。

試驗(yàn)表明，黃樟素對(duì)老鼠有致肝腫瘤的效果。1960年12月3日，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)禁止食品中有黃樟素、黃樟油、異黃樟素和二氫黃樟素的存在［11］。2001年，歐盟委員會(huì)規(guī)定黃樟素和異黃樟素的總使用限量，食品和飲料中為1 mg/kg，含酒精飲料為5 mg/kg(酒精含量大于25%);含肉豆蔻食品為 15 mg/kg［3，12－13］。2005 年，歐洲委員會(huì)將黃樟素列為懷疑弱致癌物質(zhì)，雖然沒(méi)有規(guī)定每日限量，但要求設(shè)置的盡可能低，目前正在由歐洲委員會(huì)評(píng)估［14］。黃樟素的允許攝入量，歐盟委員會(huì)估計(jì)為0.3 mg/d，或成人以60 kg體重計(jì)0.005 mg/kg［12］;世界衛(wèi)生組織估計(jì)美國(guó)人為 4 ～569 μg/d，歐洲人0.6 ～879.0 μg/d［15］。黃樟素 TD50為51 mg/kg［16］。

我國(guó)于2005年實(shí)施的《易制毒化學(xué)品管理?xiàng)l例》將黃樟素列為第一類易制毒化學(xué)品。由于黃樟素類化合物的毒副作用，建立準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的黃樟素類化合物分析檢測(cè)方法，對(duì)于評(píng)估食品、化妝品及煙草的安全性有著重要作用。目前，常用檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、氣相色譜法(GC)和氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)等，筆者簡(jiǎn)要概括了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的黃樟素類化合物分析檢測(cè)方法。

1 氣相色譜與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

直接用氣相色譜－火焰離子化檢測(cè)器(GC-FID)定量或用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)定性定量檢測(cè)是目前測(cè)定黃樟素類化合物的主要方法。

2001年，Choong等采用GC-FID分析了軟飲料中的黃樟素和異黃樟素［9］。樣品未經(jīng)處理直接進(jìn)樣，以1，4-二羥基苯(DHB)為內(nèi)標(biāo)定量，檢出限為0.25 μg/ml。分析的25種軟飲料中有20種檢出目標(biāo)物。

吳婷等為了同時(shí)分析吐司面包、番茄醬、廣式香腸、可樂(lè)、葡萄酒中的黃樟素等多種成分，采用同時(shí)蒸餾萃取方法以二氯甲烷為提取劑將待測(cè)物從食品基質(zhì)中分離出來(lái)，用1，4-二溴苯和乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)定量［17］。GC-FID測(cè)定黃樟素的方法檢出限為0.2 μg/ml。待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值與濃度比值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 54～0.999 73，空白加標(biāo)回收率為 82.147% ～98.106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.109% ～4.105%，通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上5種食品的檢測(cè)，表明該法可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行靈敏、準(zhǔn)確的定性定量分析。

王星等建立用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定化妝品中黃樟素、6-甲基香豆素的方法［18］。方法樣品用甲醇提取，超聲后定容，脫水，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，用GC-MS法定性，外標(biāo)法定量。該方法條件下，黃樟素的加標(biāo)回收率為101.3%～106.0%，RSD 為0.9% ～1.4%，測(cè)定限(以S/N=10 計(jì))為 5 μg/g。

周貽兵等將煙用香精樣品以甲醇超聲提取，提取液經(jīng)高速離心、0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，供氣相色譜測(cè)定［19］。采用SE-54毛細(xì)管柱分離樣品，經(jīng)FID檢測(cè)，外標(biāo)法定量。黃樟素的質(zhì)量濃度在1.0～50.0 mg/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈線性關(guān)系，方法的檢出限(3S/N)為0.3 mg/L。黃樟素加標(biāo)回收率在88.0% ～94.7%，RSD(n=6)在 0.8% ～4.5%。

李長(zhǎng)于等采用乙醇超聲提取，丙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量，氣相色譜－離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香精香料中黃樟素的含量［20］。選取黃樟素的母離子和子離子分別為m/z 162和m/z 131，內(nèi)標(biāo)丙酸苯乙酯選擇m/z 104為定量離子。結(jié)果表明，黃樟素在0.05～5.00 mg/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r＞0.995)，方法的檢測(cè)限(S/N=3)黃樟素為 0.002 mg/L，加標(biāo)回收率為90.0% ～131.2%。

MAHESH·PAL等將肉豆蔻果實(shí)通過(guò)水蒸氣蒸餾得到的揮發(fā)油通過(guò)GC和GC-MS進(jìn)行分析［21］。代表該精油的95.9%的28種成分被確認(rèn):黃樟素含量為3.4%。

Queila P.S.Barbosa等對(duì)一種胡椒科植物的黃樟素含量通過(guò)GC-MS和GC-FID進(jìn)行分析［22］。該組織葉、果實(shí)、莖的黃樟素含量分別為2.0%、4.8%和1.7%。GC檢測(cè)條件為:DB-5 石英毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm i.d.×0.25 μm)，起始柱溫60℃，3℃/min升到240℃。

2 液相色譜與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

近年來(lái)，由于帶有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)的液相色譜儀具有的定性定量檢測(cè)的能力，使用DAD-LC檢測(cè)黃樟素含量的報(bào)道較多，而LC-MS/MS比普通的LC有更高的分析選擇性和靈敏度，越來(lái)越多的研究采用LC-MS/MS來(lái)分析復(fù)雜食品基體中的黃樟素。

王海利等建立了利用超高效液相色譜儀檢測(cè)天然提取物中黃樟素含量的方法［23］。以無(wú)水乙醇為溶劑，振蕩萃取黃樟素后，直接進(jìn)樣。經(jīng)配置FLRD檢測(cè)器的超高效液相色譜于激發(fā)波長(zhǎng)288 nm、發(fā)射波長(zhǎng)325 nm下對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。所得回歸方程為:Y=5.51×106X+3.48×105，(R2=0.998 6，n=5)，平均回收率為95.1%，檢測(cè)限為 38.3 ng/g。

Kurt A.Reynertson等建立了高效液相色譜定量檢測(cè)一種香樟樹(shù)皮中黃樟素的方法［24］，235 nm PDA檢測(cè)，黃樟素標(biāo)準(zhǔn)物出峰時(shí)間約在20 min，回歸曲線R2=0.999 9。該植物材料的甲醇提取物中黃樟素的含量為0.435%(W/W)(±5×10－6)，方法檢測(cè)限定量限分別為1.25 μg/ml和3.75 μg/ml。

Chu Chen等建立了高效液相色譜法測(cè)定某些藥材中的黃樟素和甲基丁香酚的含量［25］，Nucleosil 100-5 C18色譜柱(5 μm，250 mm ×4.0 mm i.d.)，外加保護(hù)柱(5 μm，8 mm ×4.0 mm i.d.);流動(dòng)相為甲醇、四氫呋喃和水(52∶8∶40);流速為1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm。分析表明，黃樟素在測(cè)試的干草藥的含量范圍為0.14～2.78 mg/g。

Kate Cummings建立了超快速液相色譜(UFLC)檢測(cè)黃樟素的方法［26］。色譜條件為:YMC ODS-AQ S-8反相C18色譜柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm i.d.);流動(dòng)相:(溶劑 A)蒸餾水，(溶劑B)乙腈。HPLC的條件如下:0～5 min(B)5%，5～10 min(B)15%，10～45 min(B)100%，保留10 min;進(jìn)樣量為10 μl;235 nmUV檢測(cè)。黃樟素保留時(shí)間為(37.77±0.23)min，LOD 和LOQ 分別為1.514 mg/kg 和2.049 mg/kg。

3 我國(guó)現(xiàn)行檢測(cè)分析標(biāo)準(zhǔn)

近年來(lái)，我國(guó)相繼制定了一系列黃樟素的分析檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)。標(biāo)準(zhǔn)方法中氣相色譜是主要的檢測(cè)手段。GB/T 14454.15－2008《黃樟油 黃樟素和異黃樟素含量的測(cè)定填充柱氣相色譜法》以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，以GC-FID分析黃樟油中黃樟素和異黃樟素。SN/T 1783－2006《進(jìn)出口化妝品中黃樟素和6-甲基香豆素的測(cè)定氣相色譜法》中方法——采用甲醇超聲提取化妝品中的黃樟素和6-甲基香豆素，GC-FID測(cè)定并以GC/MS確證。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，黃樟素檢測(cè)方法的研究開(kāi)展的不算晚，主要集中在香精、香料及煙草中的研究。測(cè)定黃樟素類化合物的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)還不多，并且這些標(biāo)準(zhǔn)或法規(guī)中多數(shù)只規(guī)定了1～2種物質(zhì)的分析方法，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)方法也大多是檢測(cè)1～2種黃樟素類物質(zhì)，而隨著其他化合物的毒理學(xué)信息的報(bào)道及添加限量的控制，同時(shí)檢測(cè)多種黃樟素類物質(zhì)及其他化合物的分析標(biāo)準(zhǔn)可能將是今后制定標(biāo)準(zhǔn)的方向。

食品中黃樟素類化合物的檢測(cè)還未見(jiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法的建立，目前，僅有試驗(yàn)研究報(bào)道采用液相萃取與色譜分離結(jié)合的方法分析食品中的黃樟素。黃樟素類化合物可用作天然除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥增效劑，隨著除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的大量使用，必將造成它在食品特別是茶葉中的殘留;黃樟素也曾是很多食品的添加劑，如用于飲料，但因其對(duì)人毒害較大，已禁止作為食品添加劑使用。食品中禁用物質(zhì)的檢測(cè)，準(zhǔn)確定性至關(guān)重要，新技術(shù)、新方法的研究仍十分重要，相信食品中黃樟素類化合物的分析檢測(cè)必將朝著準(zhǔn)確化、快速化及多元化的方向發(fā)展。

［1］WINDHOLZ M，BUDAVARI S，STROUMTSOS L Y，et al.The merck index:An encyclopedia of chemicals，drugs and biologicals［M］.Rahway，NJ.USA:Merck ＆ Co.Inc，1989.

［2］BURDOCK G A.Encyclopedia of food and color additives［M］.Florida:CRC Press，1997.

［3］CARLSON M R，THOMPSON D.Liquid chromatographic determination of safrole in sassafras-derived herbal products［J］.Journal of AOAC international，1997，80(5):1023 －1028.

［4］MIGLIERINI G.Sassafras oil，a key raw material now largely banned from the market［J］.Chemistry today，2008，26(5):59 －62.

［5］OLTRAMARI A C，WOOD K V，BONHAM C，et al.Safrole analysis by GC-MS of prototrophic(Ocotea odorifera(Vell.)Rohwer)cell cultures［J］.Plant cell，tissue，and organ culture，2004，78(3):231 －235.

［6］RATSCH C.The encyclopedia of psychoactive plants［M］.Vermont:Parkstreet Press，1998.

［7］CFR，Sec.189:Code of Federal Regulations［S］.2011.

［8］SCF.Scientific Committee on Food，European Commission:Opinion of the Scientific Committee on Food on the safety of the presence of safrole(1-allyl-3，4-methylene dioxy benzene)in flavourings and other food ingredients with flavouring properties［S］.2002.

［9］SCF.Scientific Committee on Food，European Commission:Opinion of the Scientific Committee on Food on Isosafrole［S］.2003.

［10］CD-P-SP.Council of Experts on Flavouring Substances(P-SP-AR)［C］//53rd Meeting.Strasbourg，2005:12 －14 .

［11］WHO.World Health Organization:WHO Food Additives Series:60.Safety evaluation of certain food additives.The 69th Meeting of Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives［S］.2009.

［12］HERP.Ranking Possible Cancer Hazards from Rodent Carcinogens，Using the Human Exposure/Rodent Potency Index(HERP)［S］.2011.

［13］HEIKES D L.SFE with GC and MS determination of safrole and related allylbenzenes in sassafras teas［J］.Journal of chromatographic science，1994，32(7):253 －258.

［14］ZHOU G D，MOORTHY B，BI J，et al.DNA adducts from alkoxyallylbenzene herb and spice constituents in cultured human(HepG2)cells［J］.Environmental and molecular mutagenesis，2007，48(9):715 －721.

［15］CHOONG Y M，LIN H J.A rapid and simple gas chromatographic method for direct determination of safrole in soft drinks［J］.Journal of food and drug analysis，2001，9(1):27 －32.

［16］CURRó P，MICALI G，LANUZZA F.Determination of β-asarone，safrole，isosafrole，and anethole in alchoholic drinks by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of chromotography，1987，404:273 －278.

［17］吳婷，金其璋.不同食品中側(cè)柏酮、龍蒿腦、黃樟素和甲基丁香酚的含量測(cè)定［J］.中國(guó)食品添加劑，2010(1):223－228.

［18］王星，蔡天培，王超，等.化妝品中黃樟素和6-甲基香豆素的氣相色譜－質(zhì)譜測(cè)定法［J］.環(huán)境與健康雜志，2007，24(5):358 －359.

［19］周貽兵，滕明德，張明時(shí).毛細(xì)管柱氣相色譜法測(cè)定煙用香精中黃樟素和香豆素［J］.理化檢驗(yàn) －化學(xué)分冊(cè)，2011，47(1):39 －43.

［20］李長(zhǎng)于，李祖光，周示玉，等.氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定香精香料中的香豆素和黃樟素［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2011，32(5):265 －270.

［21］MAHESH P，RAJESH KUMAR V.Anti-termite activity of essential oil and its components from Myristica fragrans against Microcerotermes beesoni［J］.Journal of applied sciences and environmental management，2011，15(3):559－561.

［22］BARBOSA Q P S，DA C?MARA C A G，RAMOS C S，et al.Chemical composition，circadian rhythm and antibacterial activity of essential oils ofPiper divaricatum:A new source of safrole［J］.Quim nova，2012，35(9):1806 －1808.

［23］王海利，孟昭宇，湯建國(guó)，等.超高效液相色譜法測(cè)定天然提取物中的黃樟素［J］.香料香精化妝品，2009(6):11－13.

［24］REYNERTSON K A，BALICK M J，LEE R，et al.A traditional method of Cinnamomum carolinense preparation eliminates safrole from a therapeutic Pohnpean tea［J］.Journal of ethnopharmacology，2005，102:269 －274.

［25］CHEN C，SPRIANO D，LEHMANN T.Reduction of safrole and methyleugenol in Asari radix et rhizoma by decoction［J］.Forsch komplementmed，2009，16(3):162 －166 .

［26］CUMMINGS K.Sassafras tea:Using a traditional method of preparation to reduce the carcinogenic compound safrole［D］.South Carolina Clemson City，United States，Clemson University，2012.