胡愛軍+蔡小玲

摘要：KDN-04（08）A、C、D定氮儀為糧食、飼料、乳品、土肥、化工、醫(yī)藥、商檢樣品的理想檢測設(shè)備，與傳統(tǒng)的仲裁法測定樣品粗蛋白方法相比，具有速度快，準(zhǔn)確率高，安全簡單易操作等優(yōu)點。

關(guān)鍵詞：取樣；消化；蒸餾；滴定；計算

KDN-04（08）A、C、D定氮儀為糧食、飼料、乳品、土肥、化工、醫(yī)藥、商檢樣品的理想檢測設(shè)備，與傳統(tǒng)的仲裁法測定樣品粗蛋白方法相比，具有速度快，準(zhǔn)確率高，安全簡單易操作等優(yōu)點。KDN型定氮儀檢測整套裝置，由消化器（見圖一）、蒸餾器（見圖二）兩大部分組成。提高蛋白質(zhì)含量測定的檢測速度，關(guān)鍵要加速樣品消化的時間。KDN系列定氮儀消化裝置，由于采用井式電加熱方式，增大了消化管受熱面，使消化樣品在消化管內(nèi)取得最佳的消化效果。如果使用硒片作為催化劑可進一步加速消化煮解，大大縮短了消化時間。消化時產(chǎn)生的SO2等有害氣體，通過消化爐上的排污管經(jīng)過抽氣泵把氣體融合在水中排入下水道，有效的抑制有害氣體的外逸，又省去實驗中安裝毒氣通風(fēng)柜。試樣經(jīng)過40分鐘的消化，即能完全消化。自來水進入蒸餾器，經(jīng)穩(wěn)壓器流入蒸發(fā)爐，因水位的上升碰到電極產(chǎn)生電流，快速加熱產(chǎn)生蒸汽，對已消化完全的樣品進行蒸餾，將蒸餾過程中產(chǎn)生的硫酸銨轉(zhuǎn)化成銨并與硼酸反應(yīng)生成硼酸氫銨。然后經(jīng)滴定計算蛋白質(zhì)含量，滴定的過程是鹽酸（或硫酸）和硼酸氫銨反應(yīng)的過程。澧縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心在樣品中粗蛋白測定上進行一些探索，現(xiàn)將工作中的體會與質(zhì)檢工作者作些商討交流。

一、KDN-04 （08） A、C、D定氮儀技術(shù)參數(shù)

1.測定品種：糧食、飼料、食品、乳制品、土肥、醫(yī)藥；

2.測定范圍：含氮量0.05%-90%；

3.精度：相對差≤2%，平行差≤0.2%；

4.測定時間：消化45分鐘左右（視樣品含氮量而定，催化劑用硫酸銅、硫酸鉀則需2.5小時），蒸餾6分鐘左右；

5.電源：AC220V/50HZ；

6.功率：消化器（四孔）1200W（八孔）2400W；

7.體積：04消化器650×220×150

08消化器730×300×150；

蒸餾器380×330×740單位（mm），1000Kw；

二、操作過程

1.選取具有代表性的試樣用四分法縮減至200g，粉碎后全部通過40目篩，裝于密封容器內(nèi)，防止試樣成分變化。

2.混合催化劑：2g硫酸銅加上30g硫酸鉀，磨碎混勻。（或用35g硒粉代替）

3.稱取0.5g試樣，精確至0.0002g，，放入消化管內(nèi)，加上6.4g混合催化劑與試樣混合，加入10ml的濃硫酸和2粒玻璃珠，將消化管分別放入各個消化架各個孔內(nèi)，然后置于消化器上，放上已經(jīng)裝好密封圈的排污管，打開抽氣三通進水（自來水）使抽氣通處于吸氣狀態(tài)，在接通電源，打開各自控制開關(guān)，轉(zhuǎn)動電位器，調(diào)節(jié)電壓指示220v，使其快速消化。消化結(jié)束后（一般2.5小時），消化管及排污管和整個托架一起移到冷卻架上進行冷卻。注意：在冷卻過程中，排污管必須保持吸氣狀態(tài)（千萬不能將消化管放入水中冷卻）防止廢氣逸出。

4.混合指示劑：0.05g甲基紅加上50ml乙醇混勻后為0.1%的甲基紅乙醇溶液，0.25g溴甲酚綠加上50ml乙醇混勻后為0.5%溴甲酚綠乙醇溶液，然后把兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為三個月。

5.配制0.1mol的硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液：3ml硫酸緩緩的注入1000ml去離子水中，冷卻，搖勻。

6. 0.1mol的硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的標(biāo)定：稱取0.2g無水碳酸鈉（270℃-300℃的高溫爐中灼燒），溶于50ml水中，加入10滴溴甲酚綠-甲基紅指示劑，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由綠色變成暗紅色，記住加了多少毫升，然后煮沸2分鐘，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液再呈暗紅色，記住加了多少毫升，兩次的和為V1，同時做空白試驗，代入公式：

C=m×1000/〔（V1-V2）M〕

M為無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量的數(shù)值，為52.994

m為無水碳酸鈉的質(zhì)量的準(zhǔn)確數(shù)值，單位為g

7.40%氫氧化鈉水溶液（M∕V）：20g氫氧化鈉加上50ml蒸餾水混勻。

8.2%硼酸水溶液（M∕V）：2g硼酸加上100ml蒸餾水混勻。

9.打開定氮儀的開關(guān)，關(guān)掉排水閥打開自來水，打開面板蒸汽開關(guān)，水位達到后蒸汽開關(guān)的燈會自動亮，這時關(guān)掉自來水，打開冷卻水龍頭，儀器進入自動加熱狀態(tài)，直到蒸汽噴出來為止（再噴半分鐘）。關(guān)掉蒸汽開關(guān)，把接收液（25ml硼酸加上2滴溴甲酚綠———甲基紅指示劑）的三角燒瓶放到大圓盤上，接收管浸入液面。

10.把消化好的樣品的消化管與蒸餾器連接，稍加旋轉(zhuǎn)使其密封后打開蒸餾水開關(guān)H2O加蒸餾水20ml，關(guān)掉開關(guān)，再打開NaOH開關(guān)加50mlNaOH，關(guān)閉NaOH開關(guān)。打開蒸汽開關(guān)，儀器進入正常工作狀態(tài)，當(dāng)三角燒瓶的接收液滿150ml，下移三角燒瓶繼續(xù)蒸餾半分鐘。關(guān)閉蒸汽開關(guān)，倒掉消化管內(nèi)廢液，進行滴定計算。

三、討論

1.如果開機電源指示燈不亮，檢查電源插頭和15A熔絲管，請必須使用良好接地的三眼插座。

2.消化時如有氣體外逸，加大三通抽氣泵的進水量。在消化初始階段，需注意觀察防止試樣因急速加熱而飛濺。緩解辦法可在消化過程，當(dāng)發(fā)現(xiàn)試樣飛濺時關(guān)機5分鐘后再開機繼續(xù)加熱。

3.如果開機后電流上升中，指示燈突然不亮，請先切斷電源，檢查熔絲管是否損壞（如損壞，應(yīng)更換15A熔絲管），然后關(guān)閉冷卻水，打開排水閥和蒸汽開關(guān)進行排水，故障排除后重新開機操作。冷卻水接口必須連接自來水，其他水源不能使用（如蒸餾水或經(jīng)過處理后的深井水），如果其他水源的話，儀器內(nèi)蒸發(fā)爐因不導(dǎo)電引起儀器不能加熱，儀器將無法工作。開機前先觀察儀器右側(cè)面下部蒸發(fā)爐內(nèi)水位，應(yīng)不能超過電極底部。（如果超過請先排水，否則很容易造成儀器損壞，操作時應(yīng)先關(guān)閉冷卻水，再打開排水閥和蒸汽開關(guān)，然后排水。）打開面板上“蒸汽”開關(guān)，機器開始自動加熱，加熱期間請注意觀察面板上電流表指針是否有電流指示（如果沒有電流指示，表示儀器沒有加熱或加熱功率很小，其原因為可能水質(zhì)有問題），直到蒸汽從前下方蒸餾塑管內(nèi)噴出，讓其噴半分鐘左右。關(guān)掉蒸汽開關(guān)，儀器進入待機狀態(tài)。（如果待機時間過長，蒸餾前應(yīng)先開一下蒸汽開關(guān)，待蒸汽噴出后再關(guān)掉蒸汽開關(guān)）接收液取下（在取下接收瓶時，用少量蒸餾水沖洗導(dǎo)出管前端，洗液與吸收液合并），關(guān)掉蒸汽開關(guān)，倒掉蒸餾完的廢液儀器還原到待機狀態(tài)，接收液待滴定之用。

4.如果開機后自來水不能正常進水蒸發(fā)爐（右下方有一個觀察窗口）請用手?jǐn)D壓出水口膠管或打開后蓋擠壓穩(wěn)壓器連接到蒸發(fā)爐的橡膠管

（可能橡膠管內(nèi)有空氣）。使水正常流入蒸發(fā)爐內(nèi)進行加熱。

5.如果打開水泵或堿泵有工作聲音，但不出液體，檢查儀器內(nèi)部單向閥是否連接，消除方法是拔掉單向閥一頭橡膠管，用硬物使單向閥中間藍色維體活動即可。如果水泵或堿泵沒有工作聲音時，應(yīng)檢查2A保險絲是否斷裂。

6.試驗做完后，冷卻水不能關(guān)，每天工作結(jié)束后，清洗堿泵，方法如下：堿液管從容器中取出，放入蒸餾水容器內(nèi)（蒸餾水必須在40℃左右）的溫水中然后在蒸餾器前放上一只空的消化管，打開NaOH開關(guān)，抽取200ml蒸餾水（溫水）2-3次清洗完成，保證使用壽命，盡量減少堿泵因結(jié)晶而無法使用。

7.KDN系列定氮儀采用凱氏定氮的原理進行測定，但是不同的樣品，實際含氮量也有區(qū)別。所以，不同的樣品必須采用不同的換算系數(shù)。如花生、大豆、蠶豆、大麥小麥、燕麥等的含氮量為17.6%，求得K=5.7；蕎麥、葵花籽、亞麻籽、棉花籽、蓖麻子等換算系數(shù)則為K=5.5；玉米菜籽則為6.0；水稻為5.95，上述以外的其他樣品換算系數(shù)均適用6.25，在計算公式中A也就不一樣。

蛋白含量（%）=[（V1-V2）C×0.014×A×100]/W

公式中：V1-消耗鹽酸（或硫酸）的毫升數(shù)

V2-空白實驗時消耗鹽酸（或硫酸）的毫升數(shù)

C-鹽酸（或硫酸）的當(dāng)量濃度

0.014-1ml鹽酸（或硫酸）的當(dāng)量數(shù)

A-A固定系數(shù)（6.25，5.7等）

W-試樣重量g

空白測定：用0.1克糖代替樣品或不加樣品作空白測定。

摘要：用高效液相色譜法對飼料中維生素D3的檢測過程中，BHT（2，6-二叔丁基對甲酚）對測定會產(chǎn)生影響。當(dāng)維生素D3含量較低或檢測人員經(jīng)驗不足時，檢測峰易發(fā)生誤判，造成檢測結(jié)果的偏離。從BHT結(jié)構(gòu)和實驗入手，對檢測過程進行優(yōu)化，可消除BHT對飼料中維生素D3檢測的影響，達到準(zhǔn)確定性和準(zhǔn)確定量的目的。

關(guān)鍵詞：維生素D3；高效液相色譜儀；抗氧化劑；準(zhǔn)確定量

維生素D3是維持機體正常活動必不可少的物質(zhì)，常用于維生素D缺乏癥的預(yù)防與治療，適量的各種維生素D3作為飼料添加劑能促進禽畜生長，增強禽畜體質(zhì)，產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟效益。

飼料中維生素D3的檢測一般是按照GB/T 17818-2010進行，但是在分析檢測過程中，經(jīng)常會有飼料中維生素D3超過標(biāo)準(zhǔn)值的情況，在排除了企業(yè)添加值錯誤的情況外，本文首次發(fā)現(xiàn)了在檢測過程中添加的抗氧化劑BHT對維生素D3含量測定結(jié)果產(chǎn)生的影響，并且對其進行了詳細的討論，達到了準(zhǔn)確定量飼料中維生素D3的目的。

1.實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津；電子分析天平（德國梅特勒）；氮吹儀；圓底燒瓶（帶回流冷凝器）；電熱套；抗壞血酸；乙醇；氫氧化鉀；乙醚；氯化鈉；BHT（2，6-二叔丁基對甲酚）。

1.2 樣品前處理

稱取樣品10g，精確至0.0001g，置于250mL圓底燒瓶中，加入50mL L-抗壞血酸乙醇溶液，10mL氫氧化鉀溶液，混合均勻，沸水浴上回流30min皂化。

皂化完成后，皂化液轉(zhuǎn)移至裝有50mL乙醚的250mL分液漏斗中提取，再分別用40mL、30mL乙醚重復(fù)提取2次，棄去水相，合并三次乙醚相。用氯化鈉溶液50mL洗滌一次，棄去水相，再用50mL水洗滌乙醚提取液至中性。乙醚提取液用無水硫酸鈉脫水，轉(zhuǎn)移到100mL棕色容量瓶中，加入100mgBHT使之溶解，用乙醚定容至刻度。

取5.0mL乙醚溶液，氮氣吹干，用甲醇定容至1.0mL，高效液相色譜儀分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：C18 5μm 150×4.6 mm，流動相：甲醇：水=95：5，流速：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進樣量：20.0μL，波長：264 nm

2.結(jié)果討論

2.1 結(jié)果影響

實際測定中，我們發(fā)現(xiàn)，在1.3色譜條件下，維生素D3的含量普遍比標(biāo)示含量偏高，而且在空白基質(zhì)中，在與維生素D3對照品同一保留時間出現(xiàn)了強吸收峰，而且面積比較大，見圖2，與維生素D3對照品檢測重疊，對飼料中維生素D3的檢測產(chǎn)生影響，具體譜圖見圖1-圖4。

2.2 影響因素分析驗證

通過對樣品的分析過程進行拆解，對可能存在的影響因子一一進行排查，最后確定，用GB/T 17818-2010方法對樣品進行分析檢測，是BHT對整個的分析結(jié)果產(chǎn)生了影響。

2.2.1BHT結(jié)構(gòu)剖析驗證

維生素D3對光、熱不穩(wěn)定，在空氣中容易氧化，光化成前反式維生素D3和后維生素D3等產(chǎn)物而失去活性。在實際測定中，加入BHT抗氧化劑，可防止其氧化。

在維生素D3提取過程中，在最后一步加入了抗氧化劑BHT，對其結(jié)構(gòu)進行分析后發(fā)現(xiàn)BHT結(jié)構(gòu)與維生素D3有相似的紫外吸收基團（具體結(jié)構(gòu)式見圖5）。維生素D3在264nm下，有較強的吸收。而BHT由于具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此在由苯環(huán)共軛系統(tǒng)下π-π※躍遷產(chǎn)生B帶特征吸收在254nm下有較強的吸收，又由于在BHT結(jié)構(gòu)中，苯環(huán)上面有羥基，作為助色基團，會導(dǎo)致BHT最大特征吸收波長發(fā)生紅移，因此BHT最大吸收波長會大于254nm，因此，可以考慮，在圖2空白玉米樣中，出現(xiàn)與維生素D3相同保留時間下出現(xiàn)的物質(zhì)，是BHT帶來的干擾

2.2.2 BHT的影響實驗驗證

介于BHT對維生素D3分析可能存在的影響，稱取一定量的BHT，用甲醇溶解，按照1.3中色譜條件，進行分析，色譜圖見圖6.

從圖6中可以看出，維生素D3對照品以及樣品和單獨的BHT在保留時間都為8.45min，因此可以證明，BHT對維生素D3含量的測定產(chǎn)生了影響，在圖2中也得到了驗證。在圖3樣品中出現(xiàn)的色譜峰物質(zhì)，不完全是樣品中維生素D3，而是維生素D3與BHT疊加后得到的色譜吸收峰。因此，在GB/T 17818-2010方法下，如果單純的以保留時間作為維生素D3檢測峰的話，對測定結(jié)果會產(chǎn)生很大的影響。

2.3 BHT影響的解決方法

2.3.1流動相的優(yōu)化

為消除BHT的干擾，我們嘗試更改有機相比例。

2.3.1.1調(diào)整流動相比例為90：10

當(dāng)減小有機相甲醇的比例，調(diào)整為甲醇：水為

2.3.1.2調(diào)整流動相比例為98：2

更改流動相有機相比例為98：2時，發(fā)現(xiàn)此時維生素D3對照品和BHT能夠徹底分開，見圖8A；樣品中的VD3和BHT也能完全的分開，見圖8B，可排除BHT對維生素D3檢測的干擾。

2.3.1.3調(diào)整流動相比例為100%甲醇

繼續(xù)調(diào)整流動相比列為100%甲醇，我們發(fā)現(xiàn)，此時維生素D3對照品和BHT均無顯著相應(yīng)，具體情況見圖9。

2.3.2BHT的添加及放置時間影響剖析

介于BHT對維生素D3存在的影響，本文取同一樣品X，平行稱取兩份，X1樣品按照1.2前處理方法進行前處理檢測，X2樣品亦按照1.2前處理方法進行前處理，但最后一步，X2樣品定容時不加BHT，分別于4℃條件下放置0天（樣品編號X1、X2）、3天（樣品編號X3、X4）、7天（樣品編號X5、X6）、15天（樣品編號X7、X8），然后以2.3.1.3的色譜條件對其進行高效液相色譜檢測分析，具體實驗設(shè)計見表1。

從圖8A中，可以看出，X樣品在未加BHT的情況下，放置3天、7天以及15天的情況下，樣品中維生素D3的含量與其加入BHT檢測后的結(jié)果是基本不變的，也就是說，在檢測飼料樣品中的維生素D3時，半個月之內(nèi)檢測完畢，為了防止BHT對維生素D3的結(jié)果產(chǎn)生影響，是完全可以不添加BHT的。

3結(jié)論

本文首次發(fā)現(xiàn)了在檢測過程中添加的抗氧化劑BHT對維生素D3含量測定產(chǎn)生的影響，并且從結(jié)構(gòu)剖析方面以及單獨的實驗對其進行了驗證，優(yōu)化流動相比例，對其進行分離，同時對于檢測過程中，BHT的添加與否在不同時間內(nèi)對飼料中維生素D3含量測定的影響進行了詳細的討論。最后確定，在飼料中維生素D3的檢測過程中，流動相的比例優(yōu)化為98：2時，BHT與維生素D3可以有效的分離；其次，為避免BHT在檢測過程中產(chǎn)生的干擾，在放置15天以內(nèi)進行檢測，不加BHT進行檢測，亦可得到準(zhǔn)確的結(jié)果，排除了BHT對其的影響，達到了準(zhǔn)確定量飼料中維生素D3含量的目的，但由于維生素D3的前處理方法比較復(fù)雜，如何能夠更快速有效的檢測其含量還有待進一步研究。

參考文獻（略）