鄭小嬌，張晶，張亞卓，史晨杉，王向紅

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定，071001)

氨苯砜(dapsone，DDS)俗稱二氨基二苯砜，雙氨基雙苯砜，分子式為C12H12N2O2S，相對分子質(zhì)量為248.30，為砜類抑菌劑，多用于麻風(fēng)?。?］和某些皮膚病的治療［2］，對麻風(fēng)桿菌有較強(qiáng)的抑菌作用，大劑量使用時顯示殺菌作用。由于其作用機(jī)制與磺胺類藥物相似，兩者具有協(xié)同增效作用，在動物和水產(chǎn)養(yǎng)殖中常作為磺胺增效劑使用［3］。然而氨苯砜毒性較大，可將血紅蛋白氧化成沒有攜氧能力的高鐵血紅蛋白，引起血液系統(tǒng)反應(yīng)，如高鐵血紅蛋白血癥和溶血性貧血［1-2，4］，還可能造成粒細(xì)胞缺乏癥、周圍神經(jīng)炎、肝腎功能損害和精神障礙，嚴(yán)重者可致死亡［3］，因此我國農(nóng)業(yè)部193號、235號公告明確規(guī)定禁止以任何形式在所有食品動物中使用，且在動物性食品中不得檢出［5］;歐盟2377/90、37/2010也明確規(guī)定氨苯砜為禁用藥物［6-7］。

目前，國內(nèi)外關(guān)于食品中氨苯砜殘留檢測的報道較少，且多與磺胺類藥物同時檢測，研究方法主要有高效液相色譜法［8-9］和液質(zhì)聯(lián)用法［4，10-13］。儀器方法可以精確地進(jìn)行定量分析，但設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、對樣品純度要求較高、檢測成本高、周期長，只能用于小批量樣本抽檢，無法滿足食品安全檢測中對大批量樣本現(xiàn)場快速篩查的需要。而酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)具有敏感度高、特異性強(qiáng)、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)［14］，適合于大批量動物源食品中氨苯砜殘留的篩選和定量檢測。因此，本研究采用重氮化法制備BSA-DDS人工抗原，免疫動物后獲得的多克隆抗體，建立了直接競爭酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新西蘭大耳白兔(雄性)，河北全友實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場;氨苯砜(DDS)，德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量98.5%;牛血清白蛋白(BSA)，Sigma公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司;辣根過氧化酶標(biāo)羊抗兔，北京索萊寶科技有限公司;NaNO2、Na2CO3、NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl(分析純)，天津市科密歐試劑有限公司;

電子感量分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司;UV-2802H型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼克儀器有限公司;96孔酶標(biāo)板(Costar);酶標(biāo)儀(Thermo);洗板機(jī)(Thermo);8道微量移液器(BIOHIT);SK-1型渦旋混勻器，麒麟醫(yī)儀;SK5200H超聲儀，上?？茖?dǎo)。

1.2 DDS完全抗原的制備

采用重氮化法將半抗原DDS與載體蛋白BSA相偶聯(lián)，制備氨苯砜人工免疫抗原，合成路線見圖1。

圖1 免疫原BSA-DDS的合成路線Fig.1 Synthetic route of immunogen BSA-DDS

1.2.1 DDS重氮化

稱取6.4 mg氨苯砜，溶解于2 mL已預(yù)冷的0.l mol/L HCl中，用1 mol/L HCl調(diào)pH 值至1.5。4℃冰浴攪拌，慢慢滴加360 μL 10 mg/mL的NaNO2溶液。用KI淀粉試紙檢驗(yàn)，直至試紙變?yōu)樯钭仙Ｖ梗?℃避光攪拌反應(yīng)30 min后，即得到重氮化的DDS溶液。

1.2.2 BSA-DDS合成

稱取10.4 mg BSA，溶于2 mL CBS(0.1 mol/L，pH=9.5)溶液中，將重氮化的DDS溶液慢慢滴加到BSA溶液中，隨時監(jiān)測pH值變化(保持pH為9.0～9.5)，攪拌反應(yīng)2 h后將反應(yīng)液置于4℃，避光反應(yīng)18 h。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS(0.01 moL/L，pH值7.2～7.4)在4℃冰箱中連續(xù)透析3 d，每天換液2～3次，分裝，-20℃保存待用。

1.3 酶標(biāo)抗原的制備

采用過碘酸鈉法將DDS與HRP相連制備了酶標(biāo)抗原DDS-HRP。

1.4 免疫血清制備

以BSA-DDS為免疫抗原，首先將免疫抗原與弗氏完全佐劑等量充分乳化，以后加強(qiáng)免疫則用弗氏不完全佐劑，采用以1 mg/只的藥量背部皮下脊柱兩側(cè)多點(diǎn)(6～8點(diǎn))注射，免疫健康新西蘭大耳白兔，獲得含有多克隆抗體的免疫血清。經(jīng)ProteinA-Sephros 4B過柱純化，得到兔源抗DDS的抗體，加入0.01%疊氮化鈉分裝，-20℃保存待用。

1.5 直接競爭ELISA方法的建立

參照文獻(xiàn)［15］中的直接競爭ELISA操作方法，將抗體濃度稀釋為10 μg/mL，包被酶標(biāo)板12～14 h;將酶標(biāo)抗原(DDS-HRP)作一定倍數(shù)稀釋，將DDS標(biāo)準(zhǔn)品配成0.01、0.1、1、10、1 00、1 000 ng/mL 系列濃度做直接競爭ELISA，以DDS溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，抑制率為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 動物性食品中DDS的測定

1.6.1 樣品的前處理

牛奶。取全奶10～15 mL置于聚苯乙烯離心管中，4℃，2 000 g離心15 min，棄掉上層脂肪層，用緩沖液稀釋10倍，混勻。

蜂蜜。稱取均質(zhì)試樣(1.0±0.001)g樣本至15 mL聚苯乙烯離心管中，先加1%氨水的乙腈溶液5 mL，漩渦混合2 min，超聲提取 5 min，4 000 r/min 室溫(20～25℃)離心5 min，棄去上層有機(jī)相(正己烷)，用緩沖液稀釋5倍，混勻。

豬肉。稱取均質(zhì)試樣(1.0±0.001)g樣本至15 mL聚苯乙烯離心管中，先加1%氨水的乙腈溶液5 mL，然后加入2.5 mL正己烷，漩渦混合2 min，超聲提取5 min，4 000 r/min室溫(20～25℃)離心5 min，棄去上層有機(jī)相(正己烷)，將提取液氮?dú)獯蹈?，用緩沖液復(fù)溶，混勻。

雞蛋。稱取均質(zhì)試樣(1.0±0.001)g樣本至15 mL聚苯乙烯離心管中，先加1%氨水的乙腈溶液5 mL，漩渦混合2 min，超聲提取 5 min，4 000 r/min 室溫(20～25℃)離心5 min，棄去上層有機(jī)相(正己烷)，將提取液氮?dú)獯蹈?，用緩沖液復(fù)溶，混勻。

1.6.2 樣品回收率

向空白牛奶、蜂蜜、豬肉和雞蛋樣品中添加一定濃度的DDS標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.6.1的方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，直接競爭ELISA測定樣品中DDS濃度，每個樣品設(shè)5個重復(fù)，計(jì)算回收率和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DDS-BSA完全抗原的鑒定

以重氮化法制備了免疫原BSA-DDS，反應(yīng)過程中，偶氮后的DDS滴入BSA中時，顏色立刻變黃，最后成為橘紅色，透析和冷凍時顏色均未見褪減，初步推斷DDS與BSA結(jié)合成功。分別對BSA和BSADDS進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，根據(jù)電泳條帶的位置判斷BSA是否與DDS發(fā)生結(jié)合形成BSA-DDS(見圖2)。分別做BSA、DDS和偶聯(lián)物在200～500 nm的紫外吸收光譜圖，根據(jù)其紫外吸收光譜圖判定BSA是否與DDS發(fā)生結(jié)合形成BSA-DDS(見圖3)。由圖2可知，人工抗原BSA-DDS的遷移率比BSA電泳條帶的遷移率小。由于SDS-PAGE消除了樣品電荷對遷移率的影響，使得樣品的遷移率只與其分子量有關(guān)。分子質(zhì)量大的樣品遷移率小，分子質(zhì)量小的樣品遷移率大，則說明人工抗原BSA-DDS的分子質(zhì)量大于BSA，BSA-DDS人工抗原成功合成。由圖3可知，載體蛋白最高峰在280 nm左右處，DDS最高峰在290 nm左右，偶聯(lián)物最高峰在370 nm左右，DDS與載體BSA偶聯(lián)反應(yīng)后，其產(chǎn)物DDS-BSA的紫外吸收圖譜與載體蛋白BSA和DDS相比，最大吸收峰位置發(fā)生了位移且吸光值有所增加，這說明載體分子上已經(jīng)成功的連接了一定數(shù)量的半抗原，并根據(jù)文獻(xiàn)［16］推算出BSA-DDS偶聯(lián)比為1∶10。

2.2 直接競爭ELISA檢測方法的建立

將 DDS 標(biāo)準(zhǔn)品配成 0.01、0.1、1、10、100、1 000 ng/mL系列濃度做直接競爭ELISA，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖5)擬合方程為:y=6.963Ln(x)+39.112(R2=0.981 7)，IC50為 4.78 ng/mL，IC15可達(dá) 0.03 ng/mL，靈敏度較高。

圖2 BSA和BSA-DDS偶聯(lián)物的SDS-PAGE鑒定圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis analysis of BSA and BSA-DDS

圖3 BSA，DDS，BSA-DDS紫外掃描光譜圖Fig.3 UV scanning spectrum of BSA，DDS and BSA-DDS

圖4 氨苯砜標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of dapsone

2.3 加標(biāo)回收率

添加回收試驗(yàn)結(jié)果見表1。在牛奶中添加25、50、100 μg/kg 的 DDS，蜂蜜、豬肉和雞蛋中添加 75、150、300 μg/kg的 DDS，回收率在75.45%～91.75%，變異系數(shù)1.79%～13.03%。

3 討論

從氨苯砜(DDS)的結(jié)構(gòu)式可以看出來，DDS分子上攜帶2個氨基。其分子質(zhì)量小，結(jié)構(gòu)簡單，只有反應(yīng)原性而無免疫原性，因此必須與大分子物質(zhì)聯(lián)結(jié)，制備成完全抗原，才能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用重氮化法進(jìn)行DDS與載體蛋白偶聯(lián)，通過反應(yīng)過程中顏色變化初步斷偶聯(lián)成功，又經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析載體BSA電泳條帶和人工抗原BSA-DDS的條帶遷移率大小，表明BSA-DDS人工抗原成功合成，最后進(jìn)行紫外圖譜分析在370 nm左右明顯可見偶聯(lián)物的最高峰形，載體蛋白最高峰在280 nm左右處，DDS在290 nm左右，偶聯(lián)物紫外掃描最高峰位置發(fā)生偏移，由此證明偶聯(lián)反應(yīng)成功。經(jīng)計(jì)算DDS與BSA的結(jié)合比為10∶1。一般認(rèn)為，半抗原與載體蛋白的結(jié)合比以8～25為宜。本試驗(yàn)的免疫原結(jié)合比為10∶1，將制得的免疫原BSA-DDS免疫新西蘭大耳白得到多抗血清，純化后得到抗體，并建立了直接競爭ELISA方法。通過試驗(yàn)表明，該檢測方法對牛奶、蜂蜜、豬肉和雞蛋的最低檢測限分別可達(dá)到0.05、0.07、0.06 和 0.07 ng/mL，通過多次試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該方法靈敏度高、穩(wěn)定性好并且具有ELISA檢測法微量、高效、經(jīng)濟(jì)和方便的特點(diǎn)，可用于動物源性食品中氨苯砜殘留的大批量、快速檢測。

表1 動物性食品中氨苯砜添加回收率和變異系數(shù)(n=5)Table 1 The recovery and RSD of DDS in spiked animal foods(n=5)

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