紀(jì)懿芳，胡文忠，姜愛麗，馮可

1(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連，116600)2(大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連，116600)3(大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連，116024)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)，是一種常見的食源性致病菌，對(duì)人類危害極大，傳統(tǒng)的國標(biāo)方法檢測操作繁瑣、耗時(shí)長，要做氧化酶實(shí)驗(yàn)、圖片鏡檢、嗜鹽性實(shí)驗(yàn)和生化實(shí)驗(yàn)等步驟，因此，開發(fā)采用先進(jìn)精確的生物化學(xué)方法，快速檢測副溶血性弧菌顯得尤為重要。環(huán)介等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 Notomi［1］等在 2000 年開發(fā)的一種新型核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法，近年來應(yīng)用比較廣泛。LAMP檢測方法反應(yīng)結(jié)果的判定有濁度分析、凝膠電泳和染料法等。濁度分析和凝膠電泳需要高昂設(shè)備和繁瑣的操作程序，因此，研究新型指示劑觀察反應(yīng)結(jié)果在近幾年較為流行。本研究在LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)中加入新型指示劑羥基萘酚藍(lán)(hydroxy naphthol blue，HNB)，通過觀察體系顏色變化并判定反應(yīng)結(jié)果，發(fā)生擴(kuò)增的體系呈現(xiàn)出天藍(lán)色，而未反應(yīng)的體系則仍保持著紫羅蘭色。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明LAMP-HNB方法反應(yīng)結(jié)果可以直接用肉眼判斷，方便快捷，可有效避免污染和假陽性產(chǎn)生。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Vibrio parahemolyticus，CICC 21617)中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;VP1、VP2為實(shí)驗(yàn)室保存用于LAMP方法的特異性實(shí)驗(yàn);霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Vibrio cholera，CICC23794)、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Staphyloccocus aureus，ATCC6538)、鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Salmonella typhimurium enes，ATCC19111)、單核細(xì)胞增多性李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 (L.monocytogenes，ATCC19111)、腸出血性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Enterohemorrhage E.coli，CICC21530)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Enterotoxigenic Escherichia coli，CICC10414)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，CMCC(B)50071)蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Bacilluscereus，CMCC(B63301)、腸侵襲性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(EIEC，CICC10661)、創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Vibrio vulnificus，ATCC27562)、表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Staphylococcus，CMCC26069)、痢疾志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Shigella，CMCC51105)、普通變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Proteusvulgaris，CMCC49027)、產(chǎn)氣腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(Enterobacter aerogenes，ATCC13048)，由大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院食品安全實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑:Bst DNA聚合酶，Thermopol反應(yīng)緩沖液套裝(NEB)，betaine(Sigma Aldrich)，dNTP Mixture，MgSO4，100bp DNA ladder Maker，Taq 酶，10 ×buffer，MgCl2以及DNA marker，細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，Tris，Na2EDTA·2H2O，冰乙酸，GelRed 染料，瓊脂，牛肉浸液，NaCl，TCBS瓊脂，3.5%氯化鈉三糖鐵斜面，HBI微生物生化鑒定條。

儀器:DYY-11型電泳儀電源，DYCP-31F型電泳儀，TC-512型PCR儀(Techne公司)，BioSpectrum 310凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA模板的制備

取1 mL過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌懸液，19 830×g離心2 min，棄上清液，沉淀按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明，提取細(xì)菌基因組DNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

以副溶血弧菌不耐熱溶血素tlh為目標(biāo)基因序列，根據(jù)引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)Primer Explorer 4.0，在線設(shè)計(jì)一套LAMP引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 副溶血性弧菌LAMP引物Table 1 The primer sequences of LAMP

1.3 擴(kuò)增體系

1.3.1 LAMP-HNB擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系25 μL:10×反應(yīng)緩沖液(New England Biolabs)2.5 μL，dNTPs Mixture(TaKaRa)1.4 mmol/L，外引物 F3/B3各 0.2 μmol/L，內(nèi)引物 FIP/BIP 各1.6 μmol/L，MgSO41.5 μL，甜菜堿(Sigma)1 mol/L，Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)8U，細(xì)菌 DNA 模板 2 μL，HNB 1 μL(反應(yīng)濃度 150 μmol/L)［2］，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL，配制好混勻離心，于 65 ℃溫育60 min，80℃滅活10 min，產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時(shí)肉眼觀察反應(yīng)體系的濁度和顏色變化。

1.3.2 PCR擴(kuò)增體系

反應(yīng)體系 25 μL:包括 10 × PCR Buffe 2.5 μL(TaKaRa)，MgCl22 μL(TaKaRa)，dNTP 2 μL(TaKa-Ra)，上下游引物F3/B3各50 nmol/L，DNA模板2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL(TaKaRa)，ddH2O 補(bǔ)齊25 μL。反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃ 5 min;95℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 45 s;30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.4 特異性實(shí)驗(yàn)

采用LAMP-HNB和PCR方法對(duì)4株副溶血弧菌菌株和14株非副溶血弧菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)

1.5.1 基因組DNA靈敏度檢測

用試劑盒提取副溶血弧菌基因組DNA，用酶標(biāo)儀測定OD值計(jì)算DNA濃度，10倍比例稀釋DNA原液到10-1～10-9，同時(shí)進(jìn)行LAMP-HNB和PCR反應(yīng)。

1.5.2 細(xì)菌純培養(yǎng)物靈敏度檢測

取振蕩過夜培養(yǎng)的副溶血弧菌菌液，平板稀釋法計(jì)算菌液濃度，10倍比例稀釋10-1～10-8，用LAMPHNB法檢測靈敏度，同時(shí)做PCR實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 人工污染副溶血弧菌食品檢測

取經(jīng)國標(biāo)方法檢測不含副溶血弧菌的牡蠣樣品25 g加入到225 mL的NaCl堿性蛋白胨水中，用拍擊式均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min。取8 mL均質(zhì)液加入已知濃度為1.4×108～1.4×10 CFU/mL濃度梯度的副溶血弧菌純菌各2 mL，各取1 mL用試劑盒法提取DNA，提取DNA同時(shí)做LAMP檢測和PCR檢測。

1.6 對(duì)市售海產(chǎn)品進(jìn)行檢測

從市場中采購海產(chǎn)品，其中包括帶魚、魷魚、海蠣子、花蜆子和多春魚等40份。采用無菌操作的方法取魚肉、魚內(nèi)臟、貝肉和蝦腹節(jié)肌肉等25g加入到225 mL堿性蛋白胨水，均質(zhì)，(36±1)℃培養(yǎng)12～18 h，接種到TCBS瓊脂上，挑選可疑菌落接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h，按照GB/T4789.7—2013要求進(jìn)行革蘭氏鏡檢、氧化酶實(shí)驗(yàn)、嗜鹽性實(shí)驗(yàn)、氯化鈉三糖鐵實(shí)驗(yàn)等生化鑒定試驗(yàn)，同時(shí)取1 mL菌液按照(1.2.1)所提的方法，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒要求提取DNA用于LAMP-HNB和PCR實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP檢測方法的建立

針對(duì)副溶血弧菌tlh基因設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)羥基萘酚藍(lán)指示劑的顯色原理，羥基萘酚藍(lán)(HNB)是一種金屬離子指示劑，Mg2+與HNB結(jié)合使得反應(yīng)體系初始顏色為紫羅蘭色，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應(yīng)生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍(lán)失去了Mg2+使得體系顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，而未反應(yīng)的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應(yīng)結(jié)果。如表2所示，LAMP-HNB發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管變?yōu)樘焖{(lán)色，而未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)管仍保持紫羅蘭色。如圖1和圖2所示，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂凝膠電泳上出現(xiàn)典型的LAMP反應(yīng)階梯狀條帶，肉眼觀察反應(yīng)管有較明顯的沉淀出現(xiàn)，PCR方法觀察反應(yīng)結(jié)果在207 bp處也有較明顯的條帶。

表2 弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LAMP-HNB檢測結(jié)果Table 2 LAMP-HNB result of VP standard strain

圖1 弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LAMP檢測結(jié)果Fig.1 LAMP result of VP standard strain

圖2 副溶血弧菌PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR result of VP standard strain

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)

如表3、4 和圖3、4、5、6 所示，4 株副溶血弧菌菌株(1、2、3、14號(hào)反應(yīng)管)LAMP和PCR反應(yīng)均出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，LAMP-HNB體系顏色為天藍(lán)色(1、2、3、14號(hào)反應(yīng)管顏色為天藍(lán)色)，其他14株非副溶血弧菌(4～12、13、15～16號(hào)反應(yīng)管)未出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，LAMP-HNB仍保持紫羅蘭色(4～12、13、15～16號(hào)反應(yīng)管顏色為紫羅蘭色)，反應(yīng)有較強(qiáng)的特異性。

表3 HNB特異性檢測結(jié)果Table 3 Specificity of HNB assay

表4 HNB特異性檢測結(jié)果Table 4 Specificity of HNB assay

圖3 LAMP特異性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Specificity of LAMP assay

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

2.3.1 基因組DNA靈敏度

圖4 LAMP特異性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Specificity of LAMP assay

副溶血弧菌基因組DNA濃度為5.45×106fg/μL，10倍比例稀釋進(jìn)行LAMP檢測，如表5和圖7、圖8所示，從反應(yīng)管顏色變化和凝膠電泳圖中可以判斷，LAMP-HNB檢測副溶血弧菌基因組DNA檢測限約為54.5 fg/μL。用同樣的基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，當(dāng)菌液濃度為5.45×103fg/μL時(shí)PCR反應(yīng)不產(chǎn)生擴(kuò)增條帶。因此，LAMP-HNB檢測副溶血弧菌純培養(yǎng)物的最低檢測限為PCR的100倍(1號(hào)空白反應(yīng)管和9～11號(hào)反應(yīng)管都為紫羅蘭色，2～8號(hào)反應(yīng)管為天藍(lán)色)。

表5 HNB檢測基因組DNA的靈敏度Table 5 Detection limit of HNB for genomic DNA

圖5 PCR特異性實(shí)驗(yàn)Fig.5 Specificity of PCR assay

圖6 PCR特異性實(shí)實(shí)驗(yàn)Fig.6 Specificity of PCR assay

圖7 LAMP檢測基因組DNA的靈敏度Fig.7 Detection limit of LAMP for genomic DNA

圖8 PCR檢測基因組DNA的靈敏度Fig.8 Detection limit of PCR for genomic DNA

2.3.2 副溶血弧菌純培養(yǎng)物靈敏度

采用平板菌落計(jì)數(shù)法得原菌液濃度為1.4×108CFU/mL，把原菌液進(jìn)行10倍比例稀釋，各稀釋梯度的菌液提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，如表6和圖9、10所示，LAMP-HNB發(fā)生擴(kuò)增的反應(yīng)體系顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，而未反應(yīng)的則為紫羅蘭色，LAMP-HNB方法檢測靈敏度為140 CFU/mL，LAMP產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果與LAMP-HNB相同，PCR檢測方法的檢測靈敏度為1.4×103CFU/mL(1號(hào)空白反應(yīng)管和8、9號(hào)反應(yīng)管都為紫羅蘭色，2～7號(hào)反應(yīng)管為天藍(lán)色)。

表6 HNB靈敏度檢測結(jié)果Table 6 Detection limito of HNB

圖9 LAMP檢測純培養(yǎng)物靈敏度Fig.9 Detection limito of LAMP

2.3.3 人工污染副溶血弧菌的食品檢測

人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品中的菌液濃度為2.8×107～2.8×100CFU/mL。如表7和圖11、12所示，人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品LAMP方法的最低檢出限為2.8×102CFU/mL，平行PCR方法的檢出限為2.8×103CFU/mL。

圖10 PCR檢測純培養(yǎng)物靈敏度Fig.10 Detection limito of PCR

表7 人工污染食品樣品中副溶血弧菌HNB檢測結(jié)果Table 7 The HNB result of VP inartificially contaminated food samples

圖11 人工污染食品樣品中副溶血弧菌LAMP檢測結(jié)果Fig.11 The LAMP result of VP inartificially contaminated food samples

2.4 市售海產(chǎn)品的實(shí)際檢測

對(duì)市售海產(chǎn)品40份分別進(jìn)行LAMP-HNB檢測、PCR檢測和國標(biāo)方法檢測。其中LAMP-HNB法檢出15份為陽性，25份為陰性，PCR檢出15份為陽性25份為陰性，國標(biāo)方法檢出15份為陽性25份為陰性，檢出率為38%。其中貝類的感染率最高，高達(dá)47%。以國標(biāo)方法為標(biāo)準(zhǔn)，LAMP-HNB方法的檢出率符合率為100%。

圖12 人工污染食品樣品中副溶血弧菌PCR檢測結(jié)果Fig.12 The PCR result of VP inartificially contaminated food samples

表8 市售海產(chǎn)品檢測結(jié)果Table 8 Commercial seafood test

3 結(jié)論

LAMP-HNB方法用HNB判斷反應(yīng)結(jié)果，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應(yīng)生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍(lán)失去了Mg2+使得體系顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，而未發(fā)生反應(yīng)的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應(yīng)結(jié)果。LAMP-HNB方法檢測特異性強(qiáng)，對(duì)單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株等非副溶血弧菌的食源性致病菌行LAMP-HNB擴(kuò)增反應(yīng)，LAMPHNB終反應(yīng)體系為紫羅蘭色，對(duì)副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行LAMP-HNB擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系變?yōu)樘焖{(lán)色，二者顏色差別明顯，可以較為準(zhǔn)確區(qū)分。LAMP-HNB方法檢測靈敏度較高，對(duì)于基因組DNA的檢測限約為54.5 fg/μL，細(xì)菌純培養(yǎng)物檢測限約為140 CFU/mL，這與徐芊［3］、程曉艷［4］等報(bào)道采用 LAMP 檢測結(jié)果基本相符，同時(shí)低于祝孺剛［5］、劉琦［6］等報(bào)道的采用PCR檢測結(jié)果。

LAMP反應(yīng)過程產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼直接觀察，但較為難斷定。常用的判斷LAMP反應(yīng)結(jié)果等方法有濁度分析、凝膠電泳和染料等。但是濁度分析和凝膠電泳法需要高昂設(shè)備和繁瑣操作程序，所以研究新型指示劑觀察反應(yīng)結(jié)果在近幾年較為流行?，F(xiàn)常用的染料主要有 SYBR green［7］、鈣黃綠素［8］和 HNB［9］等。HNB 和鈣黃綠素可以在 LAMP反應(yīng)前加入，有效的減少了反應(yīng)污染的可能性，其他染料(如SYBR green)則需要在反應(yīng)后加入，加重了污染的可能性，若通過反應(yīng)前將指示劑滴加在蓋上，反應(yīng)后彈入等方法則操作不容易控制。羥基萘酚藍(lán)(HNB)是一種金屬離子指示劑，原理是Mg2+與HNB結(jié)合使得反應(yīng)體系初始顏色為紫羅蘭色，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應(yīng)生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍(lán)失去了Mg2+使得體系顏色變?yōu)樘焖{(lán)色，而未反應(yīng)的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應(yīng)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在反應(yīng)前加入1 μL(反應(yīng)濃度150 μmol/L)HNB染料觀察顏色變化判定反應(yīng)結(jié)果，并同時(shí)將產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)二者結(jié)果相同，此結(jié)果與聶凱［10］等人報(bào)道的應(yīng)用HNB檢測甲型H1N1流感病毒，呂恒［11］等人報(bào)道的應(yīng)用HNB檢測大腸埃希菌結(jié)果相同，證明HNB有較強(qiáng)的準(zhǔn)確性。

副溶血弧菌廣泛的存在于海產(chǎn)品及沿海環(huán)境中，國內(nèi)外的報(bào)道中副溶血弧菌的分離率高達(dá)68.12%［12］和 78.6%［13］，不同類別的海產(chǎn)品感染率不同，其中貝類副溶血弧菌污染較為突出，最高可達(dá)75%［14］，本文在幾種海產(chǎn)品檢驗(yàn)中也屬貝類的感染率最高，可以達(dá)到50%。人們?cè)谫徺I海產(chǎn)品時(shí)要合理安排好貯藏溫度和時(shí)間，防止交叉感染。在食用海產(chǎn)品時(shí)要盡量避免生食，要進(jìn)行充分的熱處理，隔夜的餐食食用前要充分加熱，必要時(shí)可以加食醋調(diào)味殺菌。

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