劉陽，鄧靜，吳華昌，張建軍，龔加路，鄭濱，陳建

1(四川理工學(xué)院，四川 自貢，643000)2(四川旅游學(xué)院，四川 成都，610100)

微生物生長(zhǎng)在高鹽環(huán)境下受到高滲透勢(shì)的影響稱為鹽脅迫，因此其實(shí)質(zhì)為滲透脅迫，當(dāng)鹽脅迫高到足以改變水勢(shì)，微生物的生理代謝機(jī)制也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，從而影響代謝產(chǎn)物的生成。鹽脅迫下細(xì)胞為了進(jìn)行正常的生理代謝活動(dòng)，能夠產(chǎn)生一系列應(yīng)答機(jī)制，主要表現(xiàn)在:(1)鹽脅迫蛋白的表達(dá)［1］，主要包括抗氧化蛋白、膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等;(2)鹽離子的區(qū)隔化［2］，主要是通過位于膜上的“泵”進(jìn)行離子跨膜運(yùn)輸完成的;(3)合成和積累相容性溶質(zhì)［3］，如甜菜堿、氨基酸等以提高細(xì)胞內(nèi)水活度，使細(xì)胞的體積和膨壓達(dá)到正常水平，避免細(xì)胞內(nèi)所有物質(zhì)濃度的升高。酵母細(xì)胞中常見的相容性溶質(zhì)為甘油和海藻糖［4］，細(xì)菌中常見的為四氫嘧啶和甜菜堿等［5］。

目前，隨著鹽脅迫下細(xì)胞的響應(yīng)機(jī)制等影響的進(jìn)一步加深，研究人員逐漸轉(zhuǎn)變方向，開始采用代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、比較基因組學(xué)等手段深入研究鹽脅迫對(duì)細(xì)胞代謝的影響。Schroeter［6］等的研究表明，滲透壓正調(diào)節(jié)基因在功能上和能夠減輕滲透壓的化合物(相容性介質(zhì))的合成和輸出、控制一般應(yīng)激反應(yīng)的sigB等方面相關(guān)。地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)的數(shù)據(jù)集因細(xì)胞遭受滲透壓脅迫合成增加從而積累的蛋白質(zhì)組學(xué)而豐富。Choi［7］等的研究表明高鹽環(huán)境下OJ82的β-半乳糖苷酶活性和胞外蛋白酶的活性最高，且復(fù)制起點(diǎn)高度保守，高鹽濃度下的RNA序列分析表明與細(xì)胞膜、轉(zhuǎn)運(yùn)、滲透壓、ATP合成和翻譯相關(guān)的基因都高度表達(dá)。然而這些研究大都集中于理論機(jī)制的研究，對(duì)基于中心碳代謝的具體產(chǎn)物方面的研究有所欠缺。

本研究從甜面醬中篩選出1株優(yōu)良枯草芽孢桿菌，利用氨基酸自動(dòng)檢測(cè)儀和頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了不同鹽濃度下枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的含量和種類，結(jié)合基質(zhì)消耗、菌體生長(zhǎng)和相關(guān)副產(chǎn)物的生成情況，探討了鹽脅迫對(duì)具體產(chǎn)物合成的影響，從而為深入研究不同環(huán)境下細(xì)胞能量代謝和特定產(chǎn)物生成的生理機(jī)制提供參考，并為芽胞桿菌在甜面醬發(fā)酵過程中的代謝機(jī)理提供參考方向，對(duì)甜面醬生產(chǎn)和發(fā)酵工藝的改良具有指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

菌株:從四川地區(qū)自然發(fā)酵甜面醬中篩選得到的產(chǎn)香枯草芽孢桿菌菌株B.subtilis B15。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH 7.4～7.6;發(fā)酵培養(yǎng)基1(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 5，自然 pH;發(fā)酵培養(yǎng)基2(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 50，自然pH;發(fā)酵培養(yǎng)基3(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 100，自然pH;發(fā)酵培養(yǎng)基4(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 150，自然pH。

1.2 主要設(shè)備和藥品

3，5-二硝基水楊酸，成都科龍化工試劑廠;對(duì)羥基聯(lián)苯，奧中化工有限公司。試劑均為分析純。

萃取頭(50/30 μm DVB/AR/PDMS)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6890-5975)，美國安捷倫公司;全自動(dòng)氨基酸分析儀(L-8900)，日本日立公司。

1.3 發(fā)酵方法

鹽濃度耐受性檢測(cè):將B.subtilis B15接種至含NaCl質(zhì)量濃度分別為5、50、100、150 g/L 的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基平板上(以NaCl質(zhì)量濃度為5 g/L的培養(yǎng)基做對(duì)照)，恒溫培養(yǎng)24～48 h(37℃)，觀察菌株是否能夠生長(zhǎng)，從而確定合適的鹽濃度梯度［8］;同樣的方法做菌株在液體培養(yǎng)基中的鹽濃度耐受性實(shí)驗(yàn)。

種子液的制備:在確定菌株生長(zhǎng)適宜的鹽濃度梯度的基礎(chǔ)上，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。從新鮮斜面培養(yǎng)基上挑取1環(huán)枯草芽孢桿菌接入到500 mL搖瓶中(種子培養(yǎng)基裝液量為100 mL)，于恒溫振蕩搖床上37℃培養(yǎng)24 h(轉(zhuǎn)速150 r/min)，即得種子液。

搖瓶培養(yǎng):以5%接種量將種子液分別接入不同鹽濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為170 r/min，溫度為37℃，每隔12 h取樣備用。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 理化指標(biāo)

葡萄糖:DNS 法［9］;生物量:干重法［10］;淀粉酶活力測(cè)定:DNS比色法［11］;乳酸:對(duì)羥基聯(lián)苯比色法［12］。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少取2次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值，用origin8.0軟件作圖分析。

1.4.2 氨基酸種類和含量的測(cè)定

一個(gè)樣品分析周期約60 min，分析儀有2個(gè)流路和2根柱，即:(1)分離柱(4.6 mm×60 mm)洗脫液流經(jīng)此柱，流速 0.4 mL/min，柱溫 700℃，柱壓13.098 MPa;(2)反應(yīng)柱:茚三酮及茚三酮緩沖液流經(jīng)此柱，流速0.35 mL/min，柱溫135℃，柱壓1.078 MPa。對(duì)照樣品:日立公司產(chǎn)17種氨基酸混合標(biāo)樣。

1.4.3 揮發(fā)性香氣成分測(cè)定

1.4.3.1 萃取方法

準(zhǔn)確量取6 mL發(fā)酵液于15 mL頂空瓶中恒溫水浴(60℃)，加入NaCl 0.5 g，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為600 r/min，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭平衡5 min后吸附30 min，然后將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸3 min，進(jìn)行GC-MS分析，測(cè)定B15發(fā)酵液中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)［13］。

1.4.3.2 檢測(cè)條件

色譜條件:毛細(xì)管色譜柱為 DB-WAX，規(guī)格為(60 m ×250 μm，0.25 μm);手動(dòng)無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250℃;程序升溫:初始溫度為45℃，保留1 min，以3℃/min的速率升至180℃，再以2.5℃/min的速率升至230℃，保留10 min;汽化室溫度250℃;載氣 He，流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件:EI電離源，電子能量70 eV，掃描范圍20～500 u，離子源溫度250℃;接口溫度230℃。

1.4.3.3 數(shù)據(jù)處理

由GC-MS數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)完成，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NSIT譜庫和RTLPEST譜庫相匹配，僅當(dāng)匹配度大于800(最大值為1 000)的鑒定結(jié)果才予以報(bào)道。采用峰面積歸一化法定量計(jì)算出各揮發(fā)性成分在甜面醬中的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

將B.subtilis B15分別接種至NaCl質(zhì)量濃度為5、50、100、150 g/L 的固態(tài)培養(yǎng)基和相同 NaCl質(zhì)量濃度的液態(tài)培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，B.subtilis B15能夠在NaCl質(zhì)量濃度為150 g/L的平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但無法在150 g/L的NaCl液態(tài)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可能是因?yàn)辂}脅迫相關(guān)基因在固體瓊脂平板上和液體培養(yǎng)基中的表達(dá)水平存在差異。研究表明，鹽脅迫刺激sacB基因(編碼果聚糖蔗糖酶)的表達(dá)，抑制aprE(編碼堿性蛋白酶)基因的表達(dá)，而sacB受環(huán)境影響較大，在固體瓊脂平板上的表達(dá)水平是液體培養(yǎng)基的8倍［14］。因此將發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中的NaCl質(zhì)量濃度梯度選定為 5、50、100 g/L。

2.1 不同鹽濃度下發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化

發(fā)酵液中逐漸增加的鹽濃度顯著影響B(tài).subtilis B15的代謝活動(dòng)，通過基質(zhì)消耗速率、細(xì)胞生長(zhǎng)速率、相關(guān)代謝產(chǎn)物的生成直觀地表現(xiàn)出來。以NaCl質(zhì)量濃度為5g/L時(shí)B.subtilis B15的菌體代謝活動(dòng)為對(duì)照，分別測(cè)定了NaCl質(zhì)量濃度為50 g/L和100 g/L時(shí)葡萄糖消耗情況、細(xì)胞干重變化、主要副產(chǎn)物乳酸生成和胞內(nèi)淀粉酶的活力大小，結(jié)果如圖1所示。

圖1 B.subtilis B15發(fā)酵過程中殘?zhí)恰⒕w干重、乳酸和淀粉酶活力的變化Fig.1 Change of reduced glucose，cell dry weight，lactic acid and amylase activity during B.subtilis B15 culture process

由圖1(A)和1(B)可得，B.subtilis B15在不同鹽濃度下葡萄糖的消耗呈現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，但不同時(shí)期消耗速率存在差異。發(fā)酵0～36 h 50 g/L NaCl質(zhì)量濃度下B.subtilis B15迅速適應(yīng)環(huán)境，且葡萄糖消耗速率與對(duì)照鹽濃度差異較小，但菌體干重明顯偏低，因此此階段中消耗的葡萄糖除了進(jìn)行菌體生長(zhǎng)以外，可能也用于合成某些能夠抵御高滲脅迫的相容性溶質(zhì)。在這一時(shí)期100 g/L NaCl下B.subtilis B15菌體處于生長(zhǎng)延滯期，葡萄糖消耗極慢，菌體干重緩慢增加。發(fā)酵48 h后細(xì)胞在50 g/L NaCl質(zhì)量濃度下首先達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，菌體干重達(dá)到最大(1.68 g/L)，此時(shí)發(fā)酵液中的殘?zhí)侵饕糜诋a(chǎn)物合成，持續(xù)至發(fā)酵84 h細(xì)胞衰亡，菌體干重降低(0.94 g/L)，而100g/L NaCl質(zhì)量濃度下自發(fā)酵36 h后糖耗速率顯著增加至發(fā)酵結(jié)束，可能大部分葡萄糖用于代謝產(chǎn)物的合成，菌體干重始終最低。

由圖1(C)可知，隨著鹽脅迫強(qiáng)度的增加B.subtilis B15生成乳酸的趨勢(shì)保持一致，在發(fā)酵48 h達(dá)到最大(0.29、0.33、0.40 g/L)。在該時(shí)期細(xì)胞已經(jīng)適應(yīng)了高鹽濃度，乳酸大量生成使發(fā)酵液的pH降低，改變酸堿平衡，并對(duì)電子傳遞體系相關(guān)的能量代謝產(chǎn)生影響［15］。整個(gè)發(fā)酵過程中，B.subtilis B15在100 g/L NaCl質(zhì)量濃度下無論是乳酸的生成速率還是消耗速率都高于其他鹽濃度，因此推測(cè)乳酸在細(xì)胞抗高滲脅迫過程中起重要作用，但更深層次的原因還有待探究。由圖1(D)可知，B.subtilis B15在鹽脅迫下正常合成并分泌淀粉酶。對(duì)照鹽濃度水平下胞內(nèi)淀粉酶的活力在發(fā)酵0～24 h增加至最高值(2.54 U/mL)，此后下降至發(fā)酵60 h淀粉酶全部分泌到胞外;50 g/L NaCl質(zhì)量濃度下的淀粉酶活力至發(fā)酵12 h已達(dá)到最大(3.44 U/mL)，此后下降至發(fā)酵72 h后檢測(cè)不到;100 g/L NaCl質(zhì)量濃度水平下淀粉酶的活力相對(duì)較小，發(fā)酵12 h達(dá)到最大(1.47 U/mL)，此后一直下降至發(fā)酵60 h后檢測(cè)不到，因此分泌到胞外的淀粉酶在發(fā)酵末期才能夠檢測(cè)得到，且適當(dāng)增加發(fā)酵液的鹽濃度更有利于β-淀粉酶的產(chǎn)生，與蒙健宗的結(jié)論相符［16］。

2.2 不同鹽濃度下氨基酸種類和含量的變化

在枯草芽孢桿菌代謝體系中，大部分氨基酸是以EMP途徑與檸檬酸循環(huán)的中間物——草酰乙酸和α-酮戊二酸等為碳鏈骨架生物合成的。而芳香族氨基酸的生物合成與HMP途徑中的4-磷酸赤蘚糖有關(guān)，組氨酸的合成與PRPP(5-磷酸核糖-α-焦磷酸)有關(guān)。氨基酸在微生物細(xì)胞調(diào)節(jié)滲透壓過程中發(fā)揮重要作用，Akira等認(rèn)為高含量的甘氨酸導(dǎo)致了相容性溶質(zhì)——游離氨基酸和甜菜堿類物質(zhì)的大量產(chǎn)生［17］。研究不同發(fā)酵時(shí)期氨基酸的變化，對(duì)監(jiān)測(cè)鹽脅迫對(duì)具體氨基酸代謝途徑的影響具有重要意義。B.subtilis B15發(fā)酵過程中氨基酸種類和含量的變化見表1。

不同鹽濃度下B.subtilis B15共產(chǎn)生10種氨基酸，按照代謝前體及途徑的差異將其分為4類:第1類為 Asp、Lys、Thr、Met和 Ile，第 2 類為 Ser、Gly 和Cys，第3類為His，第4類為Phe。第1類氨基酸中Asp、Met和Ile僅在10%鹽濃度下檢測(cè)到，且發(fā)酵24 h濃度最大，隨發(fā)酵過程濃度降低，Lys的濃度隨著鹽脅迫增強(qiáng)出現(xiàn)不同程度的增加，因此100 g/L NaCl濃度刺激了Asp的合成與相關(guān)轉(zhuǎn)化。第2類氨基酸中不同鹽濃度下發(fā)酵液中Ser的濃度顯著降低，Gly濃度發(fā)酵末期小幅上升，Cys參與丙酮酸的合成，高鹽濃度濃度增加，因此鹽脅迫抑制了Ser的積累，且對(duì)His和Phe的積累影響不大。

表1 B.subtilis B15發(fā)酵過程中氨基酸種類和含量的變化Table 1 Change of amino acid during B.subtilis B15 culture process

2.3 不同鹽濃度下?lián)]發(fā)性風(fēng)味成分的變化

B.subtilis B15發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味成分的色譜峰面積如表2所示。不同鹽濃度下發(fā)酵液中揮發(fā)性成分的種類和含量存在較大差異。其中不同鹽濃度的不同發(fā)酵周期都能檢測(cè)到的是3-羥基-2-丁酮，一種具有強(qiáng)烈奶油香氣的常見化合物，通過α-乙酰乳酸或2，3-丁二酮直接形成，還可以與2，3-丁二醇相互轉(zhuǎn)化。但發(fā)酵液僅僅檢測(cè)到極少量2，3-丁二酮，因此鹽脅迫可能刺激了α-乙酰乳酸脫羧酶或丁二酮還原酶的大量表達(dá)，從而導(dǎo)致3-羥基-2-丁酮大量積累。僅在10%鹽濃度發(fā)酵液能夠檢測(cè)到的物質(zhì)有4種，分別為三氯甲烷、正己醛、正己醇和糠醛，均為常見小分子香氣成分，但含量均較低且隨著發(fā)酵的進(jìn)行檢測(cè)不到，因此高鹽濃度下縮短發(fā)酵時(shí)間有利于該類物質(zhì)的積累。僅在對(duì)照鹽濃度(5 g/L NaCl)發(fā)酵過程中能夠檢測(cè)到的物質(zhì)有4種，分別為乙酸乙烯酯、甲氧基異戊酸乙酯、戊酮和異辛醇，均僅在某一發(fā)酵周期存在且含量較低。2，5-二甲基吡嗪是是一種烷基吡嗪類香料，在食品中只添加1～2 mg/L，就能起到明顯的增香作用［18］，本實(shí)驗(yàn)中在50 g/LNaCl脅迫下，以葡萄糖為單一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h，能夠檢測(cè)到少量該物質(zhì)的產(chǎn)生，說明枯草芽孢桿菌中存在2，5-二甲基吡嗪的代謝途徑，可能是不良環(huán)境條件激活了相關(guān)基因的表達(dá)。苯甲醛是最簡(jiǎn)單的芳香醛，是常見的醫(yī)藥、香料、染料合成中間體，50 g/L和100 g/L NaCl濃度下微量產(chǎn)生。

表2 B.subtilis B15發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分色譜峰面積的變化Table 2 Change of volatile flavor components during B.subtilis B15 culture process

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了不同鹽濃度下發(fā)酵液中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，其中三氯甲烷、正己醛等4種物質(zhì)僅在高鹽脅迫(100g/L NaCl)下產(chǎn)生，且大部分為醛醇等不穩(wěn)定的化合物，因此從代謝機(jī)理上存在兩種可能，高鹽脅迫刺激了其相關(guān)基因的表達(dá)，或是抑制了該類化合物的完全轉(zhuǎn)化。氨基酸分析表明這一階段中草酰乙酸途徑產(chǎn)物表達(dá)差異顯著，且產(chǎn)物合成周期一致，二者在代謝途徑和基因方面是否具有關(guān)聯(lián)性還有待進(jìn)一步研究。

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