王小蘭，穆曉清，2，徐巖，2，3，聶堯，2

1(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

2(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)

3(中國食品科技與技術(shù)重點實驗室，江蘇無錫，214122)

普魯蘭酶 (Pullulanase，EC 3.2.1.41)是能夠?qū)Ｒ恍缘淖饔糜谄蒸斕m糖、支鏈淀粉、糖原及相關(guān)低聚糖中的 ɑ-1，6-糖苷鍵，切下整個側(cè)枝的脫支酶，能提高淀粉糖化過程的效率，已廣泛應(yīng)用于以淀粉為原料的各種工業(yè)生產(chǎn)中［1-2］。但是國內(nèi)普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模較小，不能供應(yīng)國內(nèi)市場需求。高效生產(chǎn)普魯蘭酶的問題需要繼續(xù)解決。在重組大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)的來自長野芽胞桿菌(Bacillus naganoensis)的普魯蘭酶，酶的熱穩(wěn)定性更優(yōu)越，其最適溫度和pH更適合用于淀粉糖化過程［3］。

在利用乳糖操縱子誘導(dǎo)表達(dá)異源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)中，由于IPTG有潛在的毒性，對菌體生長有抑制作用，且價格昂貴，目前國內(nèi)外已有很多研究用乳糖代替 IPTG作為乳糖啟動子的誘導(dǎo)劑［4-5］。2005 年，Studier研究出自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)［6］，葡萄糖耗盡后乳糖被利用，目的蛋白才開始表達(dá)，自誘導(dǎo)發(fā)酵的最終菌體密度大，蛋白產(chǎn)量高，被廣泛應(yīng)用研究;但各菌株所需的生長條件不同，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基會進(jìn)行部分改造。

為了實現(xiàn)重組大腸桿菌中自誘導(dǎo)高效表達(dá)普魯蘭酶，本研究在7 L發(fā)酵罐規(guī)模考察了溶氧、pH和甘油及乳糖的流加的方式對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響，提高了普魯蘭酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌E.coli BL21/pET-20b-pul，本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基):蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，1000×卡那霉素溶液體積分?jǐn)?shù)為5%，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基:α-乳糖15 g/L，無水葡萄糖0.5 g/L，甘油 10 g/L，KH2PO46.8 g/L，MgSO42mmol/L，Na2HPO47.1 g/L，Na2SO40.71 g/L，NH4Cl 2.67 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，1 000×卡那霉素溶液體積分?jǐn)?shù)為5%;pH 7.60。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

普魯蘭購自東京化成工業(yè)株式會社(TCI)，其余試劑都是國產(chǎn)分析純。

超聲破碎VCX75，購自Sonic公司;恒溫水浴鍋，購自上海華連醫(yī)療器械有限公司;7 L發(fā)酵罐，購自美國NBS公司;酶標(biāo)儀，購自Thermo公司;高效液相色譜儀，購自美國安捷倫公司;高壓蒸汽滅菌鍋，購自日本Tomy公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

一級種子培養(yǎng):將菌株從甘油保存液中接到含有4 ml種子培養(yǎng)基的試管中，37℃，200 r/min(下同)振蕩培養(yǎng)10 h。

二級種子培養(yǎng):在250 ml三角瓶中，接種量10%，37℃振蕩培養(yǎng)10h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

分批發(fā)酵培養(yǎng):7 L發(fā)酵罐，最終裝液量3 L，接種量10%，攪拌速率300 r/min;于37℃條件下培養(yǎng)2 h，使菌體生長至一定濃度，再轉(zhuǎn)入20℃中培養(yǎng)，同時一次性添加終濃度為15 g/L的乳糖。(下同)

恒溶氧分批發(fā)酵培養(yǎng):調(diào)整空氣和純氧氣的通入量比例，盡量使溶氧量保持在20%～30%。

恒速流加甘油溶液分批發(fā)酵培養(yǎng):溶氧量保持在20%～30%;發(fā)酵9 h后，以0.8 g/(L·h)的速度流加濃度200 g/L的甘油溶液。

恒pH和變速流加甘油溶液培養(yǎng)分批發(fā)酵培養(yǎng):溶氧量保持在20%～30%;發(fā)酵罐自動調(diào)整氨水的流加速度，使發(fā)酵液中的pH保持在7.60;當(dāng)溶解氧濃度低于5%時，流加濃度200 g/L的甘油溶液;溶氧升高時，停止流加甘油。

恒速流加甘油和乳糖溶液分批發(fā)酵培養(yǎng):溶氧量保持在20%～30%，pH保持在7.60;發(fā)酵9 h后，以0.8 g/(L·h)的速度流加濃度200 g/L的甘油溶液;發(fā)酵20 h后，以0.2 g/(L·h)的速度流加濃度300 g/L的乳糖溶液，繼續(xù)發(fā)酵。

1.3 分析方法

1.3.1 菌體生物量的測定

菌體濃度測定采用濁度法，測定波長600 nm處的光密度(OD600nm)，采用此值表示細(xì)胞濃度。

1.3.2 溶氧及pH測定

在線檢測。

1.3.2 普魯蘭酶酶活力的測定

發(fā)酵液破碎后12 000 r/min離心10 min，取上清為粗酶液。酶活測定方法根據(jù)Jinho等的方法修改［7］。反應(yīng)溫度為60℃，緩沖體系為0.1 mol/L pH 4.50的乙酸-乙酸鈉緩沖液。1個單位的普魯蘭酶酶活力定義為在測定條件下，每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶的量。

1.3.3 發(fā)酵液中葡萄糖、甘油和乳糖濃度的測定

液相色譜法具有操作簡單，靈敏度高，重復(fù)性好和準(zhǔn)確度更高等特點，選擇液相色譜的方法測定發(fā)酵液中甘油、葡萄糖和乳糖的含量，高效液相色譜條件:La Chrom NH2色譜柱(4.6 mm ×250 mm ×5.0 μm)，V(乙腈)∶V(水)=75∶25，流速 0.8 mL/min，柱溫 40℃，示差折光檢測器溫度40℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 7L罐中普魯蘭酶分批發(fā)酵過程

如圖1所示，重組大腸桿菌快速進(jìn)入對數(shù)生長期，溶氧迅速下降;變溫誘導(dǎo)后停止生長2 h，繼續(xù)對數(shù)生長期;第7 h開始菌體處于缺氧的條件下生長;13h后溶解氧濃度迅速增長，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌濃達(dá)到最大值，OD600nm為12.58。第2 h加入乳糖降溫誘導(dǎo)表達(dá)普魯蘭酶，第4 h菌體開始快速生產(chǎn)普魯蘭酶，13 h時停止;最終普魯蘭酶酶活力為356 U/mL;比在250 mL三角瓶中的自誘導(dǎo)培養(yǎng)重組大腸桿菌的酶活力降低了63%。

圖1 重組大腸桿菌分批發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Batch fermentation of recombinant E.coli

發(fā)酵過程中的動力學(xué)參數(shù)(見圖2)可以看出，第7 h，細(xì)胞處于缺氧的環(huán)境中，同時細(xì)胞的生長速率、甘油的消耗速率和普魯蘭酶的合成速率都開始下降，說明缺氧不利于重組菌的生長和產(chǎn)酶。隨著細(xì)胞的快速生長，甘油的消耗速度從0 g/(L·h)上升到0.90 g/(L·h);但甘油消耗速度降低，細(xì)胞的生長速度也降低，考慮發(fā)酵液中的甘油對細(xì)胞生長和產(chǎn)酶有影響是需要的。在發(fā)酵過程中，乳糖以0.3 g/(L·h)的速度緩慢消耗，后期可以及時補加乳糖。

2.2 溶氧控制對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

重組大腸桿菌發(fā)酵過程中溶解氧濃度過低會抑制菌體的生長代謝，不利于產(chǎn)酶;研究報道，溶氧濃度維持在20%～30%［8］有利于重組大腸桿菌的生長和外源蛋白的高效表達(dá);在發(fā)酵罐中，通過控制純氧和空氣的混合比例可以有效控制發(fā)酵液中的溶氧濃度。在7 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，控制氧氣濃度在20%～30%，結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)重組大腸桿菌在17 h出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象，25 h出現(xiàn)菌體濃度最大值，OD600nm為38.25;重組大腸桿菌產(chǎn)酶也出現(xiàn)階段性，25 h普魯蘭酶酶活力達(dá)到最大值698 U/mL，酶活力增長96%。結(jié)果表明，通過控制發(fā)酵液中的溶解氧濃度，可以有效提高重組大腸桿菌發(fā)酵生物量和普魯蘭酶的表達(dá)。

圖2 重組大腸桿菌分批發(fā)酵動力學(xué)研究Fig.2 Study the kinetics of batch fermentation of recombinant E.coli

圖3 恒定溶氧濃度下重組大腸桿菌的發(fā)酵結(jié)果Fig.3 Batch fermentation of recombinant E.coli on constant dissolved oxygen

在自誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，重組大腸桿菌先利用葡萄糖;葡萄糖消耗完后，利用甘油生長和產(chǎn)酶;乳糖是重組菌的誘導(dǎo)劑，作用到乳糖操從子，開始表達(dá)普魯蘭酶，但甘油耗盡，乳糖被用為碳源;進(jìn)而產(chǎn)生重組大腸桿菌明顯的二次生長現(xiàn)象。葡萄糖在2 h內(nèi)快速用完;降溫誘導(dǎo)表達(dá)普魯蘭酶，甘油被快速消耗;12 h后，乳糖被用作碳源，34 h后被消耗完(見圖4)。34h后，重組菌體處于營養(yǎng)缺失時期，菌體生長和產(chǎn)酶都停止。

圖4 發(fā)酵過程中葡萄糖、甘油和乳糖殘留量的濃度變化Fig.4 Variation tendency of residual glucose，glycerol and lactose concentration during the fermentation

2.3 恒速流加甘油對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

要獲得普魯蘭酶的高效表達(dá)，則需要高的菌體濃度，流加碳源是一個好的選擇［9］。在恒溶氧發(fā)酵過程中，根據(jù)重組菌細(xì)胞的生長情況計算，甘油做碳源時，細(xì)胞的平均生長速率為2.3/h;乳糖做碳源時，細(xì)胞的平均生長速率僅為1.2/h，所以及時補加甘油可以有效增加菌濃。恒速流加補料方式滿足了菌體對甘油的需要［10］。在恒溶氧發(fā)酵過程中，甘油在2 h～12 h被大量消耗，根據(jù)甘油的消耗曲線計算，甘油在此階段的平均消耗速率為0.8 g/(L·h);因此在9 h時，以0.8 g/(L·h)的速度流加甘油。結(jié)果如圖5所示，隨著甘油的積累，菌體開始遲緩生長，產(chǎn)生了底物抑制現(xiàn)象;60h后，菌濃達(dá)到最大值，OD600nm為41.76;普魯蘭酶酶活力同樣達(dá)到最高值1 099 U/mL;通過恒速流加甘油，普魯蘭酶酶活力增加了57%。

圖5 恒速流加甘油的重組大腸桿菌的補料發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Fed-batch fermentation of recombinant E.coli with supplementation of glycerol on constant concentration

重組菌生長過程中分泌一些代謝產(chǎn)物，影響發(fā)酵液中的pH值，進(jìn)而抑制重組菌的生長和產(chǎn)酶［11］。如圖6所示，重組菌體快速生長，發(fā)酵液的pH會慢慢降低，在60 h時pH降低到5.0，重組停止生長和產(chǎn)酶。

2.4 恒pH和DO-stat對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

為了消除甘油的抑制作用，采用DO-stat的發(fā)酵模式-用溶氧濃度作為反饋指標(biāo)來流加營養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵方式［13］。細(xì)胞由于營養(yǎng)缺失導(dǎo)致溶氧濃度上升，通過補加甘油來降低溶氧濃度，可以有效的控制甘油的濃度，防止甘油積累和有害代謝產(chǎn)物的生成［14］。pH低于5.0時，重組菌的蛋白質(zhì)和DNA不可逆降解會導(dǎo)致細(xì)胞裂解［12］，發(fā)酵液中流加氨水保持發(fā)酵液中的pH 7.60不變。研究結(jié)果如圖7所示，第3 h開始根據(jù)溶氧控制甘油流加，64 h后菌體停止生長，達(dá)到最大值，OD600nm為40.80;71h后酶活力停止增加，最大值為944 U/mL。與恒速流加甘油的結(jié)果相比，普魯蘭酶酶活力降低16%。上述結(jié)果說明恒速流加甘油更加有利于重組菌的生長和產(chǎn)酶。

圖6 發(fā)酵過程中pH和溶氧的變化曲線Fig.6 Variation tendency of pH and oxygen concentration during the fermentation

圖7 恒pH的重組大腸桿菌的發(fā)酵結(jié)果Fig.7 Fed-batch fermentation of recombinant E.coli on constant pH

2.5 恒速流加乳糖和甘油對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

在自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)過程中，乳糖是誘導(dǎo)表達(dá)普魯蘭酶基因的誘導(dǎo)劑，從圖4和圖5可知，發(fā)酵過程中乳糖會被消耗，并且發(fā)酵后期乳糖會缺失，適當(dāng)時機補加甘油和乳糖，可以提高普魯蘭酶的產(chǎn)量。根據(jù)圖4中的甘油和乳糖的消耗曲線顯示，乳糖在0～20 h被用作誘導(dǎo)劑消耗，計算的平均消耗速率為0.2 g/(L·h)。因此發(fā)酵過程中，第9 h，以0.8 g/(L·h)的速度流加200 g/L的甘油，第20 h，以0.2 g/(L·h)的速度流加300 g/L的乳糖;根據(jù)恒速流加甘油的發(fā)酵結(jié)果，在82 h結(jié)束流加甘油和乳糖。重組菌在79h停止生長和產(chǎn)酶，細(xì)胞濃度達(dá)到最大值，OD600nm為42.45，比初始的菌濃約增加了3.4倍;普魯蘭酶最高值為1 200 U/mL，比初始的酶活也約增加了3.4倍(見圖8)。

圖8 恒速流加乳糖和甘油的重組大腸桿菌的發(fā)酵結(jié)果Fig.8 Fed-batch fermentation of recombinant E.coli with supplementation of glycerol and lactose on constant concentration

3 結(jié)論

本文在7L發(fā)酵罐內(nèi)對產(chǎn)普魯蘭酶的重組大腸桿菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)動力學(xué)參數(shù)改善了分批補料培養(yǎng)工藝?？疾炝丝刂迫苎鹾蚿H對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響，確定了甘油和乳糖的補料工藝。優(yōu)化后的最佳發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件:溶氧濃度保持在20%～30%;pH保持在7.60;第9 h時，以0.8 g/(L·h)的速度流加甘油;在20 h，以0.2 g/(L·h)的速度流加乳糖。此條件下，重組菌的細(xì)胞濃度從12.58上升到42.25，提高了3.36倍;普魯蘭酶酶活力從356 U/mL上升到1 200 U/mL，提高了3.37倍，實現(xiàn)了重組菌E.coli生產(chǎn)的普魯蘭酶的高效表達(dá)，為普魯蘭酶進(jìn)一步發(fā)酵罐放大生產(chǎn)提供依據(jù)。

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