畢春元，任婷月，張金玲，杜祎，李敬龍

1(山東省科學院生物研究所山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南，250014)

2(齊魯工業(yè)大學食品與生物工程學院，山東濟南，250353)

葡萄糖氧化酶(GOD)是一種需氧脫氫酶，能夠專一地催化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，具有去除葡萄糖、脫氧、測血糖含量等作用，還可以代替生物發(fā)酵法生產葡萄糖酸鹽［1］。但GOD催化反應生成的H2O2會造成GOD中毒，使得固定化GOD的使用壽命縮短。過氧化氫酶(CAT)能夠迅速將H2O2分解為H2O和 O2，可有效除去反應生成的 H2O2［2］。將CAT引入到GOD的催化體系中，將兩種酶固定于同一載體上，實現(xiàn)共固定化，可以消除H2O2對GOD活性的破壞作用，延長共固定化GOD-CAT的使用壽命［3］。

有關GOD及CAT的共固定化研究，國內外已有許多報道，如管文軍等［4］將GOD和CAT共同固定在尼龍66膜上，制備出用于臨床檢驗的血糖試紙;Ozyilmaz等［5］用硅酸鎂載體共固定黑曲霉GOD與牛肝臟CAT，與單獨固定化GOD相比，共固定化GODCAT的催化活性提高了70%;Zhang Jie等［6］將GOD和CAT共固定在賴氨酸改性的新型交聯(lián)殼聚糖微球上，GOD酶活回收率67.1%，固定化酶的耐酸性和耐熱性均增加。然而，這些方法仍然存在一些缺點，比如由于傳質阻力的影響，反應過程中生成的H2O2不能迅速分解，從而導致GOD和CAT失活，固定化酶的重復使用穩(wěn)定性不高。

離子交換樹脂由于具有穩(wěn)定的物化性質及適當的粒度和孔結構，且在連續(xù)運轉中損耗較小，適宜連續(xù)化生產，所以適合做固定化酶的載體［7］。離子交換樹脂固定化酶采用離子交換吸附的方式，但是樹脂與酶蛋白結合的不夠緊密。本研究對5種樹脂的固定化效果進行篩選，發(fā)現(xiàn)了能較好共固定化GOD與CAT的D201離子交換樹脂。以D201為載體采用吸附-交聯(lián)法共固定化GOD與CAT，對其固定化條件進行了探討，并研究了共固定化GOD-CAT的酶學性質，為固定化酶在葡萄糖酸鹽生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶，山東欣宏藥業(yè)有限公司;無水葡萄糖、25%戊二醛、牛血清白蛋白，國藥集團化學試劑有限公司;考馬斯亮藍 G-250，北京中生瑞泰科技有限公司;D 311大孔弱堿性丙烯酸系陰離子交換樹脂、D 301大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂、D201大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂、D202-II大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂、SQD-96大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂，江蘇蘇青基團;SBA-40 D型生物傳感儀，山東省科學院生物研究所;HZQ-F 160振蕩培養(yǎng)箱，廣州峻祺實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GOD與CAT的共固定化方法

1.2.1.1 樹脂的預處理

一定量陰離子交換樹脂→去離子水清洗多次→2倍體積4%NaOH浸泡6 h→去離子水清洗，至pH=9左右→2倍體積4%HCl浸泡6 h→去離子水清洗至pH=6左右→用2倍體積去離子水浸泡備用。

1.2.1.2 固定化方法

將 GOD∶CAT 按活力比5∶1，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5溶解于 0.2 mol/L 一定 pH 值的磷酸鹽緩沖液，配制成10 mg/mL的GOD和CAT混合酶液，稱取上述預處理后的樹脂1 g，用濾紙吸干表面水分，分散于一定體積上述酶混合液中，放入振蕩培養(yǎng)箱中吸附，搖床轉速為150 r/min。吸附完成后，加入一定量的25%戊二醛溶液攪拌均勻，將其靜置于4℃冰箱中進行交聯(lián)。交聯(lián)完成后，用蒸餾水充分洗滌樹脂5次以上，以除去未固定上的游離酶，即得到共固定化GOD和CAT的樹脂。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 GOD酶活力的測定

游離酶活力采用滴定法測定［8］，固定化酶活力的測定參照游離酶活的測定方法，酶活力為3次實驗的平均值。

1.2.2.2 CAT酶活力的測定

游離酶活力的測定:采用分光光度法在25℃下測定［9］，反應總體積為3 mL，含0.1 mL酶液樣品和2.9 mL 0.1 mol/L的H2O2溶液(用pH=7.0磷酸鹽緩沖液配制)，用紫外可見光分光光度計在240 nm下測定H2O2的分解速率。

酶活定義為:在上述反應條件下，1 min分解1 μmol H2O2所需的酶量為1個酶活力單位(U/mL)。

式中:n為酶液稀釋倍數;V0為混合液總體積;V1為酶液樣品的體積;43.6 mol/(L·cm)為H2O2在240 nm下的摩爾消光系數。

固定化酶活力的測定參照游離酶活的測定方法，酶活力為3次實驗的平均值。

1.2.2.3 固定化酶活回收率

1.2.2.4 蛋白質濃度測定

采用考馬斯亮藍法［10］，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.2.2.5 過氧化氫含量的測定

采用SBA-40 D型生物傳感分析儀測定［11］。

1.2.2.6 共固定化GOD和CAT的活力表征

底物為用0.2 mol/L pH6磷酸鹽緩沖液配制的濃度為100 g/L的葡萄糖溶液，在250 mL的三角瓶中加入上述葡萄糖溶液30 mL，同時加1.2.1所得的共固定化GOD-CAT樹脂10 g，進行氧化的同時用SBA-40 D型生物傳感分析儀測定殘?zhí)橇?，氧化溫?5℃，pH=6.0，殘?zhí)菫?時氧化結束，氧化結束后回收共固定化GOD-CAT樹脂。以葡萄糖轉化率表觀酶活性，葡萄糖轉化完全時相對酶活為100%。

2 結果與討論

2.1 樹脂載體的選擇

分別選擇5種不同型號的陰離子交換樹脂按照1.2.1所述方法進行GOD和CAT的共固定化，GOD∶CAT=1∶1(酶活力之比)，吸附 pH=7.5，吸附溫度30℃，吸附時間10 h，戊二醛質量分數為1%，交聯(lián)溫度4℃，交聯(lián)時間12 h，其固定化結果見表1。

表1 不同樹脂的固定化效果(以GOD計)Table 1 The immobilization effect of three kinds of resins

由表1可知，D201型樹脂的固定化效果最好，酶活回收率達27.6%，D301型樹脂的固定化效果最差。大孔樹脂并存有細微孔和大網孔，對有機大分子物質較易吸附和交換，GOD和CAT兩種酶的等電點都在微酸性區(qū)，故本研究采用大孔陰離子交換樹脂作為載體進行GOD和CAT的共固定化。D201為大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂，其功能基團為［—N(CH3)3OH］季氨基，其強型基團容量高于其他4種樹脂，與兩性酶蛋白進行離子交換的幾率高，故選擇D 201樹脂作為本研究的固定化載體。

2.2 D 201共固定化GOD和CAT的條件優(yōu)化

2.2.1 GOD-CAT加酶比例的選擇

選擇不同的GOD/CAT酶活比1∶5～5∶1，總體積為6 mL，固定其他條件進行吸附交聯(lián)。測定GOD酶活，同時測定反應液中H2O2的濃度。

如圖1所示，在 GOD/CAT酶活比1∶5～5∶1的范圍內，當GOD/CAT酶活比小于1∶1時，H2O2的質量濃度一直保持在0 mg/L，當GOD與CAT酶活比大于1∶1時，H2O2的質量濃度隨比值的增加逐漸增加;固定化酶活力隨著GOD與CAT酶活力比值的增加而增加，在GOD/CAT為1∶1時，固定化酶活力達到最大，以GOD計，固定化酶酶活為36 U/g，之后逐漸下降。原因可能是GOD和CAT同時進行固定化，一方面，隨著共固定化GOD-CAT上CAT量的增多，GOD催化生成的H2O2被分解得越快，H2O2對GOD的破化作用越小，所以共固定化GOD-CAT樹脂的GOD活力逐漸增加;另一方面，兩種酶同時固定化時，存在競爭偶聯(lián)，隨著GOD/CAT的減小，GOD固定到載體上的量減少，因而共固定化GOD-CAT樹脂的GOD活力又逐漸下降。H2O2質量濃度取決于GOD/CAT的值，且在H2O2濃度小于7 mmol/L的微環(huán)境中GOD比較安全［6］。因此，綜合考慮固定化酶活和H2O2濃度，適宜的加酶比例選擇GOD∶CAT=1∶1。

圖1 GOD與CAT酶活力之比對共固定化的影響(以GOD計)Fig.1 Effect of enzyme activity ratio of GOD/CAT

2.2.2 吸附pH的選擇

固定其他條件，分別在不同pH條件下進行吸附，測定共固定化GOD-CAT樹脂的GOD酶活力和酶活回收率。

圖2 吸附pH值對共固定化的影響(以GOD計)Fig.2 Effect of adsorption pH on the co-immobilization

本研究選取的D 201樹脂是強堿性陰離子交換樹脂，在不同pH環(huán)境下都能工作，GOD和CAT的等電點都在微酸區(qū)，因此選擇在pH=6.5～9.0條件下進行吸附。由圖2可以看出，在pH 7.5時，固定化酶活和酶活回收率最大，這可能與本實驗所用GOD和CAT的pH穩(wěn)定性有關，在特定的pH值條件下，酶分子的活性基團才能處于最佳的離子狀態(tài)，使酶顯示出較高的活力，從而影響固定化酶的活力，過高或過低的pH均會使固定化酶活力降低，因此，最適的吸附pH為7.5。

2.2.3 吸附溫度的選擇

固定其他條件，分別在不同溫度下吸附，測定共固定化GOD-CAT樹脂的GOD酶活力和酶活回收率。

從圖3可知，30℃為最佳吸附溫度。這可能是因為:蛋白質的吸附是吸熱過程，溫度較高時蛋白質分子運動加劇，減小了酶的擴散限制作用，使酶分子能更快擴散進入載體的孔道內并與載體發(fā)生相互作用，加快固定化［12］，但溫度過高時，則可能引起酶因熱變性而失活。

圖3 吸附溫度對共固定化的影響(以GOD計)Fig.3 Effect of adsorption temperature on the co-immobilization

2.2.4 吸附時間的選擇

選擇不同的吸附時間，固定其他條件進行固定化，分別測定共固定化GOD-CAT樹脂的GOD酶活力和酶活回收率。

圖4 吸附時間對共固定化的影響(以GOD計)Fig.4 Effect of adsorption time on the co-immobilization

圖4可以看出，8 h前隨著吸附時間的增加，固定化酶活力與酶活回收率均增加，6 h以后，基本達到平衡，這是因為隨著時間的延長，陰離子交換樹脂表面的可交換基團與酶蛋白的交換已逐漸達到平衡，再增加吸附時間，樹脂上的可交換基團幾乎沒有了，所以交換緩慢，故本實驗選擇8 h為最佳吸附時間。

2.2.5 戊二醛質量分數的確定

分別選擇不同質量分數的戊二醛，固定其他條件進行固定化，分別測定共固定化GOD-CAT樹脂的GOD酶活力和酶活回收率。

從圖5可知，戊二醛質量分數為1.0%～2.0%時，固定化效果最好。在交聯(lián)過程中，戊二醛既是固定化反應的交聯(lián)劑，又是酶的變性劑，當戊二醛質量分數較低時，較少的酶蛋白與樹脂交聯(lián)，交聯(lián)反應進行不徹底，酶固定化不牢固;若質量分數過高，過度的分子內交聯(lián)反應會影響酶活性中心與底物的結合，從而降低了酶活，所以戊二醛質量分數以1%為宜。

圖5 戊二醛質量分數對共固定化的影響(以GOD計)Fig.5 Effect of glutaraldehyde concentration on the co-immobilization

2.2.6 交聯(lián)溫度的選擇

固定其他條件，選擇不同的交聯(lián)溫度進行固定化，測定共固定化GOD-CAT樹脂的GOD酶活力和酶活回收率。

圖6 交聯(lián)溫度對共固定化的影響(以GOD計)Fig.6 Effect of crosslinking temperature on the co-immobilization

從圖6可以看出，交聯(lián)溫度在4℃時固定化酶活力和酶活回收率最高，原因可能是戊二醛的交聯(lián)性質只有在一定的pH條件下才會充分顯示出來，溫度偏高或偏低都會改變戊二醛的pH環(huán)境，使其降低或喪失交聯(lián)功能，所以選擇交聯(lián)溫度為4℃。

2.2.7 交聯(lián)時間的選擇

固定其他條件，改變交聯(lián)時間進行固定化，分別測定測定共固定化GOD-CAT樹脂的GOD酶活力和酶活回收率。

由圖7可以看出，隨著交聯(lián)反應時間的延長，酶活力逐漸增加，超過8 h以后，酶活力增加緩慢。這是因為交聯(lián)反應前期主要是酶分子間的交聯(lián)反應，當酶分子間交聯(lián)達到飽和后，進行分子內交聯(lián)，可能導致酶活性中心被戊二醛覆蓋，另外，戊二醛上的醛基數目有限，再增加交聯(lián)時間固定化酶活力提高也有限，所以交聯(lián)時間以8 h為宜。

圖7 交聯(lián)時間對固定化效果的影響(以GOD計)Fig.7 Effect of crosslinking time on the co-immobilization

2.3 共固定化GOD和CAT的性質研究

2.3.1 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

將共固定化GOD-CAT樹脂2 g和GOD酶液0.2 mL分別在65℃的恒溫水浴中處理2.5 h和pH=4.0的緩沖液中4℃處理2.5 h，取出后測定酶活力，以未處理前的固定化酶所測得的酶活為100%，以相對殘留酶活來表示共固定化GOD-CAT樹脂隨著熱處理和pH處理時間的不同的酶活變化情況。

圖8 共固定化酶的熱穩(wěn)定性(以GOD計)Fig.8 Thermal stability of co-immobilized GOD/CAT

圖9 共固定化酶的pH穩(wěn)定性(以GOD計)Fig.9 pH stability of co-immobilized GOD/CAT

從圖8和圖9可以看出，在65℃和pH 4.0條件下處理2.5 h后，固定化酶活力分別下降到原來的72.6%和74.0%，而游離酶活力分別下降到原來的10%和22%。固定化酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性較游離酶都有了顯著的提高，原因可能是酶經固定化后，載體對酶分子起到保護作用，具有更加穩(wěn)定的空間立體結構，降低了酶對不利環(huán)境的敏感性，因此在熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性方面會較游離酶有一定的提高［13］。

2.3.2 間歇操作穩(wěn)定性

在pH 6.0、45℃條件下采用同一批共固定化GOD-CAT樹脂連續(xù)進行10次間歇式葡萄糖催化反應，并以第1次反應表征的催化活力作為100%，以相對殘留酶活來表示固定化酶隨著使用次數的增加的酶活變化情況，并作圖(圖10)。

圖10 共固定化酶的間歇操作穩(wěn)定性(以GOD計)Fig.10 Intermittent operation stability of co-immobilized GOD/CAT

從圖10可以看出，在循環(huán)使用10次后，仍能保持90%以上的相對酶活，由此可見，該固定化酶具有良好的重復使用穩(wěn)定性。

2.4 共固定化GOD-CAT樹脂的應用

取兩個1 000 mL三角瓶，分別加入300 mL用0.2 mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液配制的濃度為100 g/L的葡萄糖溶液，同時分別加入GOD酶液10 mL和1.2.1所得的共固定化GOD-CAT樹脂100 g，氧化溫度35℃，氧化同時流加1 mol/L NaOH溶液維持體系pH的穩(wěn)定，并產生葡萄糖酸鈉，同時采用SBA-40 D型生物傳感分析儀反應液中殘余葡萄糖濃度，當殘?zhí)菫?時氧化結束，測定反應時間。

由圖11可知，與游離酶相比，固定化酶初始反應速率偏低，但是整個反應過程速率較為平穩(wěn)，最終二者均在反應進行18 h后結束。原因可能是，與游離酶相比，固定化酶存在擴散阻力，故初始反應速率偏低，隨著反應的進行，固定化酶受反應液中其他因素的影響較小，反應速率略高于游離酶。

圖11 共固定化酶的應用Fig.11 Application of co-immobilized GOD/CAT

3 結論

本文比較了5種離子交換樹脂對對共固定化GOD與CAT的固定化效果，篩選出大孔強堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂D201為載體，通過先吸附后交聯(lián)的方法共固定化GOD與CAT，優(yōu)化的固定化條件為:取 GOD∶CAT=1∶1，在 30 ℃、pH7.5 的條件下吸附反應8 h，加質量分數為1%(酶活力之比)的交聯(lián)劑戊二醛在4℃交聯(lián)8 h，以GOD計，獲得的固定化酶最高酶活回收率為30.8%。將得到的共固定化GOD-CAT樹脂用于催化制備葡萄糖酸鹽，操作穩(wěn)定性令人滿意。

本研究制備的共固定化GOD-CAT樹脂，不僅成功地消除了H2O2對GOD的毒害作用，具有良好的重復使用穩(wěn)定性，而且固定化效率高，生產成本低，有利于可持續(xù)發(fā)展。在下一步的研究中，有望將其應用于葡萄糖酸鹽的工業(yè)化生產中，提供一種生產過程簡單，產品純度高，能耗低的生產方法。

［1］ Sandip B B，Mahesh V B，Rekha S S，et al.Glucose oxidase:an overview［J］.Biotechnology Advances，2009，27(4):489-501.

［2］ FAN J，YIN J J，NING B，et al.Direct evidence for catalase and peroxidase activities of ferritin-platinum nanoparticles［J］.Biomaterials，2011，32(6):1 611-1 618.

［3］ 李丕武，李瑞瑞，劉佃磊，等.磁性生物活性玻璃共固定葡萄糖氧化酶-過氧化氫酶的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29(9):2 180-2 185.

［4］ 管文軍，龔興國，李榮宇.葡萄糖氧化酶/過氧化物酶膜共固定化的研究［J］.浙江大學學報(工學版)，2002，36(2):209-211.

［5］ Glu Z，Tukel S S.Simultaneous and sequential co-immobilization of glucose oxidase and catalase onto florisil［J］.J Microbiol Biotechnol，2007，17(6):960-967.

［6］ ZHANG J，ZHOU X H，WANG D，et al.Studies on the coimmobilized GOD/CAT on cross-linked chitosanmicrosphere modified by lysine［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2013，97:80-86.

［7］ 王佳興.固定化酶與離子交換樹脂［J］.水處理技術，1985，11(4):1-7.

［8］ 孫君社，江正強，劉萍.酶與酶工程及其應用［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2006:281-282.

［9］ Bergmeger H U，Bergmeyer J，Grabl M，et al.Methods of Enzymatic Analysis［M］.Weinheim:Verlag Chemie Press，1963:274-280.

［10］ 王文平，郭祀遠，李琳.考馬斯亮藍法測定野木瓜多糖中蛋白質的含量［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29(1):115-117.

［11］ 孔維琴，陳志偉，高廣恒.生鮮牛乳中過氧化氫的電極檢測［J］.食品科學，2012，3(18):177-180.

［12］ 趙麗芳.脂肪酶的固定化及催化性能研究［D］.長春:吉林大學，2008.

［13］ Monier M，El-sokkary A M A，Sarhan A A.Immobilization of Candida rugosa lipase on modified natural wool fibers［J］.Reactive ＆ Functional Polymers，2010，70(2):122-128.